重组人促红细胞生成素的生产与应用
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（3）上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱（C4填料），10%～70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。
（4）上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。
在透析过程中，透析液的体积为蛋白液的15倍体积，过夜，并分四次换液。在上离子交换柱前用0.22 μm滤膜过滤。在上RP-HPLC柱前样品蛋白含量为0.37 mg/ml，经无菌过滤后制成粗品再进一步纯化。在上凝胶柱前蛋白含量约为1.0 mg/ml，最后得到产品蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活>1.2×105 IU/mg。
⑤rhuEPO预处理（皮下注射）能减轻二尖瓣置换术患者的血清心肌酶及肌钙蛋白表达，具有显著的保护心肌作用。
⑥rhEPO治疗能促进新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）患儿神经功能的早期回复，除对红细胞增生有促进作用外，对其他系统无不良反应。
⑦重组人促红细胞生成素不仅能改善慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者的贫血状态，而且可改善患者的营养状况和红细胞免疫功能。
二、重组菌构建过程
重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。
Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。
由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。
重组人促红细胞生成素的生产与应用
任雅怡3090102202
摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。
关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发
一、重组人促红细胞生成素的性质
（5）收获培养物，4℃~8℃保存。
③培养工Baidu Nhomakorabea控制
生物反应器由于各种辅助配件比较完善、因此具有许多优点，如无菌操作安全可靠、保温和气体交换可靠，能保持pH值稳定，监视控制自动化，产物的收集和新液的补充持续进行以及载体有足够的表面积等，非常适于基因工程细胞的高密度、高表达连续培养。但不同的细胞，其最适生长和表达条件不完全相同，必须摸索出最适培养条件。
②构建表达红细胞生成素的细胞株
以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。
（2）收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。
（3）0～2 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。
（4）收集活性洗脱峰10 mmol/L Tris透析液透析过夜。
②红细胞生成素的精制
（1）透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。
（2）0～1 mol/L NaCl- Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。
②大剂量治疗多发性骨髓瘤患者相关性贫血优于数学，其起效快、疗效好，患者生活幸福感改善明显，费用成本低，安全性好。
③应用重组人促红细胞生成素可以明显改善肝移植受者术前存在的贫血状态，减少术中异体血液的输注量和术后继续需要输注异体血液的可能。
④恶性血液病完全缓解的患者巩固化疗中，应用rhEPO2万U每周1次疗法治疗化疗相关性贫血可以减少输血量和相关治疗费用，并减少输血相关副作用和患者的痛苦。
虽然采用有血清培养基有效刺激细胞的分化和增殖，但无血清的合成培养基用于生产，可降低纯化过程中杂蛋白质的含量，减少纯化的负载，并延长层析色谱柱使用寿命，有效提高产品的纯度。
3、红细胞生成素的分离纯化工艺过程
①红细胞生成素的初级分离
（1）CM－Sephrose亲和层析柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡缓冲液平衡。
三、重组人促红细胞生成素的生产工艺
1、表达红细胞生成素的细胞系
①构建红细胞生成素表达载体
有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。
在刚接种后细胞稀少时，搅拌速度缓慢，使细胞牢固地贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度，以便使细胞周围的微环境中代谢产物和营养物质都在较短的时间内达到平衡。
动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。因此，对温度的控制应较为严格。恒定的温度(37℃)及pH值(7.2)也是较为理想的条件。
pH值也是细胞培养的关键性参数，它能影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，应先通过实验寻找出最适pH值，再通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。细胞生长与表达的pH值为7.0~7.2。
Amgen公司开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一种“高糖基化”促红素产品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元,市场前景不可估量。同时，强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元，2002年销售额42.69亿美元， 2003年销售收入达到39.84亿美元。
将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。
EPO现阶段的临床应用主要有治疗慢性肾病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、肿瘤、充血性心力衰竭、中枢神经系统疾病、认知功能受损、丙型肝炎病毒（HCV）感染等疾病患中、治疗中或恢复期的贫血和组织缺氧症状。
2、临床试验效用
以下结论来自一些具体相关临床试验的研究文献：
①rhuEPO明显促进红细胞生成，安全、可靠地改善妊娠期贫血。
⑧EPO能改善急性病毒性心肌炎临床症状，减轻心肌损伤，降低心律失常、急性左心衰发生率。
五、重组人促红细胞生成素的市场开发状况
1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人促红细胞生成素（rhEPO）。自从1989年FDA批准红细胞生成素[Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit] 用于临床连续治疗需要透析的慢性肾衰病人以来，很多国家也已经批准红细胞生成素上市和生产，并且市场表现不俗。重组红细胞生成素(EPO)目前的销售额一直排在生物医药类产品的前三名，每年的增长率在10％以上。
促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。
氧是细胞代谢中最重要的养分之一。它可以直接和间接地影响细胞的生长与代谢。溶解氧应在10％~100％的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气按比例的混合气体以控制溶氧。
葡萄糖是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度，细胞生长、表达旺盛时，需大量消耗，而缺乏时细胞生长速度与产物表达量均降低，故应及时充分地予以补充。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。
（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速<50 r/min，37℃，DO 50%～80%，进行贴壁培养。
（3）转速提高到80~100 r/min，继续扩增培养10天。
（4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。
①种子细胞制备
（1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。
（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。
（3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。
（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。
②反应器连续培养
（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。
四、重组人促红细胞生成素的应用
1、应用情况概述
重组人红细胞生成素（rhuEPO）是最早用于临床的重组基因工程药物之一，可促进骨髓内原始血细胞加速分化，促进有核红细胞加快成熟及血红蛋白合成，刺激网织红细胞和成熟红细胞释放，并稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治疗慢性肾性贫血，之后随着对众多疾病相关性贫血的病理生理过程以及EPO、铁和红细胞生成三者间相互关系的深入认识，EPO的临床应用逐步扩展。
2、CHO细胞培养工艺过程
在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。
转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。
（4）上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。
在透析过程中，透析液的体积为蛋白液的15倍体积，过夜，并分四次换液。在上离子交换柱前用0.22 μm滤膜过滤。在上RP-HPLC柱前样品蛋白含量为0.37 mg/ml，经无菌过滤后制成粗品再进一步纯化。在上凝胶柱前蛋白含量约为1.0 mg/ml，最后得到产品蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活>1.2×105 IU/mg。
⑤rhuEPO预处理（皮下注射）能减轻二尖瓣置换术患者的血清心肌酶及肌钙蛋白表达，具有显著的保护心肌作用。
⑥rhEPO治疗能促进新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）患儿神经功能的早期回复，除对红细胞增生有促进作用外，对其他系统无不良反应。
⑦重组人促红细胞生成素不仅能改善慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者的贫血状态，而且可改善患者的营养状况和红细胞免疫功能。
二、重组菌构建过程
重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。
Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。
由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。
重组人促红细胞生成素的生产与应用
任雅怡3090102202
摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。
关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发
一、重组人促红细胞生成素的性质
（5）收获培养物，4℃~8℃保存。
③培养工Baidu Nhomakorabea控制
生物反应器由于各种辅助配件比较完善、因此具有许多优点，如无菌操作安全可靠、保温和气体交换可靠，能保持pH值稳定，监视控制自动化，产物的收集和新液的补充持续进行以及载体有足够的表面积等，非常适于基因工程细胞的高密度、高表达连续培养。但不同的细胞，其最适生长和表达条件不完全相同，必须摸索出最适培养条件。
②构建表达红细胞生成素的细胞株
以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。
（2）收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。
（3）0～2 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。
（4）收集活性洗脱峰10 mmol/L Tris透析液透析过夜。
②红细胞生成素的精制
（1）透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。
（2）0～1 mol/L NaCl- Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。
②大剂量治疗多发性骨髓瘤患者相关性贫血优于数学，其起效快、疗效好，患者生活幸福感改善明显，费用成本低，安全性好。
③应用重组人促红细胞生成素可以明显改善肝移植受者术前存在的贫血状态，减少术中异体血液的输注量和术后继续需要输注异体血液的可能。
④恶性血液病完全缓解的患者巩固化疗中，应用rhEPO2万U每周1次疗法治疗化疗相关性贫血可以减少输血量和相关治疗费用，并减少输血相关副作用和患者的痛苦。
虽然采用有血清培养基有效刺激细胞的分化和增殖，但无血清的合成培养基用于生产，可降低纯化过程中杂蛋白质的含量，减少纯化的负载，并延长层析色谱柱使用寿命，有效提高产品的纯度。
3、红细胞生成素的分离纯化工艺过程
①红细胞生成素的初级分离
（1）CM－Sephrose亲和层析柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡缓冲液平衡。
三、重组人促红细胞生成素的生产工艺
1、表达红细胞生成素的细胞系
①构建红细胞生成素表达载体
有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。
在刚接种后细胞稀少时，搅拌速度缓慢，使细胞牢固地贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度，以便使细胞周围的微环境中代谢产物和营养物质都在较短的时间内达到平衡。
动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。因此，对温度的控制应较为严格。恒定的温度(37℃)及pH值(7.2)也是较为理想的条件。
pH值也是细胞培养的关键性参数，它能影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，应先通过实验寻找出最适pH值，再通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。细胞生长与表达的pH值为7.0~7.2。
Amgen公司开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一种“高糖基化”促红素产品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元,市场前景不可估量。同时，强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元，2002年销售额42.69亿美元， 2003年销售收入达到39.84亿美元。
将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。
EPO现阶段的临床应用主要有治疗慢性肾病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、肿瘤、充血性心力衰竭、中枢神经系统疾病、认知功能受损、丙型肝炎病毒（HCV）感染等疾病患中、治疗中或恢复期的贫血和组织缺氧症状。
2、临床试验效用
以下结论来自一些具体相关临床试验的研究文献：
①rhuEPO明显促进红细胞生成，安全、可靠地改善妊娠期贫血。
⑧EPO能改善急性病毒性心肌炎临床症状，减轻心肌损伤，降低心律失常、急性左心衰发生率。
五、重组人促红细胞生成素的市场开发状况
1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人促红细胞生成素（rhEPO）。自从1989年FDA批准红细胞生成素[Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit] 用于临床连续治疗需要透析的慢性肾衰病人以来，很多国家也已经批准红细胞生成素上市和生产，并且市场表现不俗。重组红细胞生成素(EPO)目前的销售额一直排在生物医药类产品的前三名，每年的增长率在10％以上。
促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。
氧是细胞代谢中最重要的养分之一。它可以直接和间接地影响细胞的生长与代谢。溶解氧应在10％~100％的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气按比例的混合气体以控制溶氧。
葡萄糖是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度，细胞生长、表达旺盛时，需大量消耗，而缺乏时细胞生长速度与产物表达量均降低，故应及时充分地予以补充。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。
（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速<50 r/min，37℃，DO 50%～80%，进行贴壁培养。
（3）转速提高到80~100 r/min，继续扩增培养10天。
（4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。
①种子细胞制备
（1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。
（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。
（3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。
（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。
②反应器连续培养
（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。
四、重组人促红细胞生成素的应用
1、应用情况概述
重组人红细胞生成素（rhuEPO）是最早用于临床的重组基因工程药物之一，可促进骨髓内原始血细胞加速分化，促进有核红细胞加快成熟及血红蛋白合成，刺激网织红细胞和成熟红细胞释放，并稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治疗慢性肾性贫血，之后随着对众多疾病相关性贫血的病理生理过程以及EPO、铁和红细胞生成三者间相互关系的深入认识，EPO的临床应用逐步扩展。
2、CHO细胞培养工艺过程
在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。
转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。