LC-MS流动相的选择
液相色谱流动相的选择依据及使用注意事项
液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种常用的分离和分析方法，它使用液体作为流动相，在不同组分之间进行分配和分离。
在液相色谱分析中，流动相是至关重要的，它直接影响分离效果、分析速度和结果准确度。
合理选择液相色谱流动相并注意使用时的一些问题是非常重要的。
一、液相色谱流动相的选择依据1. 样品的性质液相色谱中流动相的选择应考虑样品的性质，包括溶解性、稳定性、挥发性等。
对于极性样品，常使用极性溶剂作为流动相；对于不容易溶解的非极性样品，可以选择非极性溶剂作为流动相。
2. 柱子的选择不同的柱子需要选择不同的流动相，以保证分离效果。
对于反相色谱柱，一般使用的是乙腈或甲醇和水的混合物作为流动相；对于正相色谱柱，则需要选用不同的极性溶剂作为流动相。
3. 分离效果流动相的选择应考虑到所需的分离效果。
对于需要高分离效果的分析，流动相的组成和流速需要进行精细调控；对于一些不需要高分离效果的分析，可以适当简化流动相的组成，提高分析效率。
4. 色谱柱的保护对于某些对色谱柱有损害的物质，可以考虑在流动相中添加一些保护剂，以延长柱子的使用寿命。
二、使用注意事项1. 流动相的配制在使用液相色谱分析时，需要注意流动相的配制。
流动相的配制应准确、稳定，避免在实验中因流动相的质量问题导致结果失真。
2. 流速的控制流速的控制对于分析结果的准确性和重现性有着重要影响。
在选择流速时，需要根据分离效果的要求以及柱子的性能来进行合理的设定。
3. 流动相的贮存流动相在储存和使用过程中需要注意避免受到污染和氧化。
定期更换和清洗流动相的储存容器，保持流动相的纯净度和稳定性。
4. 流动相的回收在实验结束后，应注意对流动相进行回收和处理，避免对环境造成污染。
总结回顾：液相色谱分析中流动相的选择和使用是至关重要的。
合理选择流动相，可以提高分析的准确性和重现性；注意使用时的一些问题，可以延长柱子的使用寿命并保护环境。
需要根据样品的性质、柱子的选择以及分离效果来综合考虑流动相的配制和使用。
液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)的各种模式探索1
实验七液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。
二、实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。
但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。
LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。
现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS已经成为最重要研究方法之一。
质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。
（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。
Agilent 6120 LC-MS 使用
•
左键单击“溶剂瓶”图标，出现左侧选框， 输入溶剂瓶 A、B 、C、D内流动相的实际 体积和停泵的体积，单击“确定” 。如果 各溶剂瓶溶剂体积小于停泵体积，泵将自 动停止。
3. 排气泡
• ⑴旋开排气阀（逆时针），右 键单击“四元泵”模块，选择 “方法”，出现左侧选框，将 溶剂A设到100%，泵流量逐步 增大到5ml/min，排出管线中的
5. 四元泵参数设定
•
右键单击“四元泵”模 块，选择“方法”，出 现左侧选框，设置流量 （1ml/min），选择流动 相及流动相比例，设置 运行时间单击“确定”。
6. TCC参数设定（一般情况下不用操作此步骤）
•
右键单击“TCC”模 块，选择“方法”， 出现左侧选框，设置 温度（30℃），单击 “确定”。
Agilent 6120 LC-MS 操作流程
一、开机前准备
• 1. 根据待测样品准 备流动相； • 2. 配制样品（最好 是用流动相做溶 剂）。
二、LC-MS测样操作流程
• 1. 在工作站页面上打开各模块电源。左键单击“ 择“开启”，紫外灯才会点亮。 ” ，开启各模块；右击DAD模块，选
2. 更新各溶剂瓶体积
气体3～5分钟，直到管线内由
溶剂瓶到泵入口无气泡为止。 • ⑵依此勾选B、C、D溶剂分别 排气（若没有加入溶剂，则不 需要排气泡）。 • ⑶将泵的流量设到0ml/min关闭 排气阀（顺时针）。
4. 进样器参数设定（一般情况下不用操作此步骤）
•
右键单击“进样器”模块， 选择“方法”，出现左侧 选框，设置进样量、洗针 瓶位置，单击“确定”。
7. DAD参数设定
•
右键单击“DAD”模 块，选择“方法”， 出现左侧选框，勾选 信号（A、B、C等8个 信号），设置波长， 单击“确定”。
第三章 LC-MS
优点：形成的是单电荷的准分子离子， 优点：形成的是单电荷的准分子离子，不 会发生ESI 会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生 信号重叠、降低图谱清晰度的问题； 信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应 高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放 高流量的梯度洗脱的流动相； 电使流动相离子化， 电使流动相离子化，能大大增加离子与样 品分子的碰撞频率， 品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度 个数量级。 高3 个数量级。
2）ESI接口的结构 ESI接口的结构
ESI 源主要由五部分组成：1）流动相导入 源主要由五部分组成： 装置； 真正的大气压离子化区域； 装置；2）真正的大气压离子化区域；3） 离子取样孔； 大气压到真空的界面； 离子取样孔；4）大气压到真空的界面；5） 离子光学系统。 离子光学系统。
接口主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜 组件构成。 组件构成。 离子化室和聚焦单元之间由一根带惰性金属 金或铂）包头的玻璃毛细管相通。 （金或铂）包头的玻璃毛细管相通。它主要 作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差， 作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差， 传输由离子化室形成的离子进入聚焦单元并 隔离加在毛细管入口处的高电压。 隔离加在毛细管入口处的高电压。离子聚焦 部分一般由两个锥形分离和静电透镜组成， 部分一般由两个锥形分离和静电透镜组成， 并可以施加不同的调谐电压。 并可以施加不同的调谐电压。
离子的输送：大气压条件下形成的离子， 离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位 差的趋使下（当然也有压力差的作用） 差的趋使下（当然也有压力差的作用）, 通过取样 孔（sampling cone）进入质谱真空区。离子流通 cone）进入质谱真空区。 过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区， 过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区， 在毛细管的出口处形成超声速喷射流。 在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析 物带电荷并且动量大， 物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的 锥形分离器的小孔，进入第二降压区， 锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后 进入质谱。 进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少 量的溶剂，由于呈电中性而且动量小， 量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一 和第二降压区被抽走。 和第二降压区被抽走。
高效液相色谱（LC-MS）标准操作规程
上海伍丰LC-100标准操作规程1．目的规范LC-100型高效液相色谱系统的使用和维护。
2．范围本规程LC-100型高效液相色谱系统的使用和维护。
3．职责质检室仪器分析员负责LC-100型高效液相色谱系统的日常使用和维护。
4．规程4.1 系统组成：本系统由1个LC-100溶剂输送泵，Rheodyne 7725i手动进样阀、LC-100紫外检测器、WS-100工作站和台式电脑等组成。
4.2 准备4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。
4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。
4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。
4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
4.3 开机4.3.1接通电源，依次开启泵、检测器前面板右下角电源开关，待泵和检测器自检结束后（检测器自检需3-5分钟），打开电脑显示器、主机。
4.3.2启动工作站4.3.2.1确认仪器自检通过后，打开计算机电源，双击电脑桌面WS-100图标。
4.3.2.2 进入实时控制及采样画面：4.3.2.3 打开泵的排液阀（逆时针旋180度），排气泡1-2分钟。
再关闭排液阀，待基线平稳（大约需要30分钟左右）数据采集参数设置请单击工具条按钮，进入数据采集参数设置对话框，如图所示：请您输入采集的自动停止时间，各项屏显参数，数据采集的文件名称，采集文件自动保存路径。
文件名称的设置：用户可以自定义文件的命名规则，请鼠标单击名称设置按钮，系统弹出文件命名规则对话框，如图所示：系统会以“前缀+时间”或“前缀+序列号”方式自动命名采样文件。
您还可以在数据采样中更改自动生成的文件名称。
保存路径设置：用户可以自定义文件的保存路径，请鼠标单击保存路径设置按钮，系统弹出保存路径选择对话框，如图所示：开始进样分析：待基线在零点走平后和数据采集参数设置好后即可进样分析。
色谱联用技术(LC-MS).
常用于强极性化合物及高分子化合物的测定，一般 不适于非极性或弱极性化合物的分析；
由于温度较低，因此较适用于热不稳定化合物；
只能允许非常小的液体流量（0.2~1mL）。
② 大气压化学源(API-±CI、APCI)
大气压化学源 工作原理
与ESI相似，所不同的是通过电晕放电针首先 使溶剂离子化，离子化的溶剂与待分析物气态分 子发生离子交换反应，形成准分子离子，使分析 物离子化。
（1）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合 物以及易挥发盐的缓冲溶液。 若流动相需用缓冲溶液，该缓冲液最好具有挥发 性，这样可pH值，调节 流动相的pH。
蛋白酵素
流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以 增强离子的解吸作用，离子化效率提高。 （2）流速：和色谱柱的内径有关，内径越小流量越 小。 0.3 1.0 2.1 4.6 内径(mm) 10 30~60 200~500 >700 流速(μl/min)
母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的 化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同， 但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫 描功能在药物代谢研究中十分重要。
Product Ion Scan(子离子扫描)
-After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID -Q1 is fixed, Q3 sweeps a given mass range -Used for structural elucidation（结构确认） -First step to developing quantitative method
（2） 负离子方式
2. LC-MSMS操作流程
LC-MSMS操作流程启动液质联用装置：接通电源：确保质谱主机、液相色谱各单元和电脑已经接通电源（请务必确定电源的稳定和不会出现突然断电的情况！！），依次打开质谱主机、液相色谱各单元和电脑的电源开关（质谱主机电源键位于仪器背后的红色按钮，液相色谱各单元的电源开关位于各单元正面的左下方），此时可观察到各单元的绿色指示灯依次亮起【注：若有某个单元的红色指示灯亮起，请及时联系岛津工程师进行处理】。
检查氮气与氩气的使用情况，氮气正常压力水平为0.69MPa-0.8MPa，氩气正常压力水平为0.5MPa-0.8Mpa，打开氩气钢瓶和液氮罐的阀门。
一、质谱主机的开启：电脑开机完毕后，请确认电脑右下方的相关图标为绿色。
【注：如果该图标为黄色，说明系统正在启动，请稍等片刻。
如果该图标为红色，表示有错误产生，请重启电脑。
】二、启动真空系统：注：抽真空时只需打开CID气（氩气），调谐时氩气与氮气均需打开。
1. 双击电脑桌面上的图标，等待，直到出现下面的界面，用户名为默认设置，密码为空，点击“确定”启动分析程序；2. 打开质谱右后方的开关，打开CID（氩气）；3. 在新出现的窗口中点击左侧的“仪器”，再双击右侧的“MSMS”，在新出现的窗口中点击左侧的“主项目”，再点击“主项目”最下方的“系统控制”，然后在弹出的小窗口中点击“手动操作”按钮；将CID GAS 右侧的“打开”按钮按下，以便打开碰撞气。
之后点击“自动启动”进行抽真空，等待小窗口中绿色进度条走完之后，真空检测的进度条恢复成原始的灰色（此过程大约需要30min），关闭CID气总阀门（使用前打开），再抽24h方可进样分析。
三、调谐：（在“LC-MS操作流程及维护说明”下“LCMS-8040的维护说明视频6”）。
1. 打开氩气与氮气；2. 去掉DL管上的堵针器，将调谐液与离子源上的进样口连接；3. 在桌面上点击“仪器”图标，再双击右侧的“MSMS”，在新出现的窗口中点击左侧的“主项目”，再点击“主项目”最下方的“系统控制”，然后在弹出的小窗口中点击“手动操作”按钮，将CID GAS 右侧的“打开”按钮按下，以便打开碰撞气。
LC-MS知识介绍
1、如何看质谱图(1)确定分子离子，即确定分子量：氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。
与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。
(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式：高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式，低分辨质谱利用元素的同位素丰度。
M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(3)峰强度与结构的关系，丰度大反映离子结构稳定：在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键的电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断。
2、离子源EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。
CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。
FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。
FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱)。
ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离是最软的电离方式，采用离子蒸发，通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-单电荷离子；化合物无需具有挥发性，离子在溶液中已生成；样品流速0.2-1mL／min；适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)，生物大分子产生多电荷离子，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。
APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization): 大气压化学电离也是软电离技术，高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子；化合物要具有挥发性且热稳定，离子在气态条件中生成；样品流速0.2-2mL／min；只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。
LC-MS联用原理及应用
质谱仪器： 质谱仪由以下几部分组成
数据及供电系统
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质谱解析的一般步骤 (适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好) (1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当 (2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据 等.
(3) 尽可能判断出分子离子。 (4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如 M-1， M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失 H，CH3，H2O，HF，OCH3...... (5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对 比。
进样系统 离子源
质量分析器
检测接收器
┗━━━━━╋━━━━━━┛
真空系统
真空系统 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免 发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用 液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。
现代有机和生物质谱进展 在 20 世纪 80 及 90 年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量 500Da 以下的小分子化合物。20 世纪 70 年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定 分子量高达 1500~2000Da 的非挥发性化合物，但重复性差。20 世纪 80 年代初发明了快原子 质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。 随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质 谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。
第七期为什么LC-MS流动相中的TFA最好换成FA呢
第七期为什么LC-MS流动相中的TFA最好换成FA呢？2014-02-26蒋竞波谱分析为什么LC-MS流动相中的TFA最好换成FA呢？正负离子模式下，如何选择流动相添加剂1）首先流动相中加入TFA或FA，对HPLC部分主要是维持流动相的pH，让一些酸性化合物在色谱柱上有良好的峰形，二者酸性强弱稍微有一些差别，同为0.1%的浓度的情况下，TFA的pH是2.1 FA的是2.7，二者大概相差半个pH单位，2）对于LC-MS测试的时候，其实流动相的条件，天然是由HPLC的条件决定，因为上LC-MS一般情况下都是为了鉴定HPLC里面产生的特殊小杂质，如果完全沿用一样的方法做LC-MS，便于跟踪到杂质的情况，但是有一些HPLC方法是完全不能平移到LC-MS上去的，比如流动相中有HClO4，H3PO4等高沸点酸，以及对离子抑制比较强烈的TFA，4）从理论上来说，我们可以通过调节FA的浓度，来补偿pH，对于有一些情况这个办法会有用，但是对于一些情况这个办法也不管用，比如为了替换0.1%TFA,可以考虑使用0.4%-0.5%甲酸替代，可以获得比较接近的pH5）现在回过头来讨论一下，为何FA比TFA更加适合如做MS呢，首先需要强调一下，TFA体系，在正离子模式下，基本上是能满足我们做LC-MS 响应要求的，这个地方的优越主要是在负离子模式下的，他们都是一元有机酸，分子结构式分别是HCOOH , CF3COOH，我尝试找了一些资料来解释，但是感觉这些都没有比较直接的解释好这个问题，虽然这个答案不太完美，还是把这些东西归纳一下，第一从化合物电离的角度来说，做负离子模式最好使用碱性流动相，这样化合物比较容易离子化为负离子，所以从这个理论出发，甲酸的酸性弱一些，pH高一些有利于负离子化，（这个好像还是有点牵强，因为二者pH相差不到半个单位），第二个就是甲酸的分子量46比TFA 114要小很多，甲酸根以及TFA酸根在MS负离子模式下是有很强的本底响应和吸收的，TFA酸性强于甲酸，所以在相同浓度下面，TFA体系里面的酸根浓度更大，本底吸收更强（这个理由就有点像我们的HPLC选择紫外光谱波长，如果选择到流动相的截止波长，我们也是基本找不到样品信号的），分子量114造成的本底干扰也远比46要大，假如你的样品的分子离子峰也在114左右那就悲催了第三有人说TFA是一个离子对试剂，结构上的3个F能够和柱子上面的碳链相互左右（难到这个作用是F和CH之间形成的H键），同时离子对试剂的还有一个特征那就是和体系里面的离子结合，使其变成中性（我仔细研读了一下离子对试剂工作原理，从这个角度讲应该是对正离子模式的抑制要强才对，）6）唉搞了半天还是没有搞明白，不过仪器公司的建议还是需要听听的，如果你有更加合理的解释可以告诉我们哦。
LC-MS基本知识
LC-MS基本知识离子化方法选择：根据样品性质确定离子化方式适合ESI(IS)的样品类型：–高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；–胺类、季铵盐等；–含杂原子化合物如氨基甲酸酯等适合APCI的样品类型：–弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等–含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等ESI不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等；APCI不适合的化合物：非挥发性样品；热稳定性差的样品离子化方法选择● 碱性化合物宜用正离子方式● 酸性化合物宜用负离子方式● 如未知,可能正负都要做● 有些化合物正、负模式都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的优先试用正离子方式根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些● 流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率● 是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定当本底增大，LC压力增高，应更换水相。
溶解样品的溶剂：用流动相或甲醇、乙腈溶比用含水多的溶剂LC 峰系形好。
如果常用的流动相不能很好溶解样品，可用少量特殊溶剂先将样品溶解后再用流动相稀释。
APPI，适合非极性化合物，同GC/MS有重复，但一般小型台式GC/MS，分子量范围小，APPI比GC/MS可测更高的分子量。
特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是LC／MS 测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时LCMS的TIC上往往看不到峰，此时，根据上一步得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值,观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC-MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM 等其他扫描方式的测定时参考。
质谱分离过程：进样，离子化，离子分离，离子检测，质谱图高效液相色谱(HPLC)是分离化合物范围最广，准确度高，对化合物破坏性小的快速分离方法，特别适用于有机生物分子的分离。
LC-MS使用注意事项
LC-MS使用注意事项LC/MS操作注意事项首先确定LC分析条件包括: mobile phase,gradient及column 等,并自备solvents,solvent/waste bottles,sample vials (1.8 ml).每次操作时: 分析前及完成后,需清洗管线至少半小时以上,确保无残留污染.MS分析条件已知或已找到相关参考资料.进入chemstation后,首先需check tune为pass才可进行以后之操作,否则立即通知仪器中心助理.条件设定,质谱解析及报告A. LC设定1. Column2. 液相条件- 移动相的选择3. Set up Pump4. Set up Injector5. Set up DAD SignalsB. MS设定条件参考1.电喷雾(ESI)之3个基本步骤2.化学电离(APCI)之3个基本步骤:3.MS 雾化室(MSD spray chamber)4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方)6.选择离子检测(SlM)/ 扫描(scan)模式C. MS说明与解析:1.四极杆质量分析器有两种扫描方式:2.质谱常用术语3.质谱图相关概念4. LC-API/CID/MS5. MS解析规则与条件说明6. API电离步骤及过程:7. ESI 及APCI 最佳化条件8.将现有的LC方法改编为LC/API-MS方法9.萃取离子层析图(EIC)10. 建立校正表D. ReportA. LC设定1. Column :(1)通常填充物质的粒径3-10 μm的管柱是可用的.(2)大於10 μm的填充物不适合LC/MS分析,因为峰扩散很大.(3)粒径3-5 μm的填充物是较理想的.5 μm管柱可能更适合扫描模式,其峰宽度会比较小粒径的管柱宽.峰出现花费较少时间,可以有足够扫描速度和扫描整个峰.如果数据采集太快,损失谱图质量.3.5 μm管柱具有增加层析分辨率和灵敏度的优点.提高的分辨能力可更可靠地分离同分异构体.(4)根据实验需要选择Column的长度,对高流量简单分析用短Column.总分析时间会较短,当为复杂样品时,需要较长Column的分离能力.2. 液相条件- 移动相的选择(1) 非挥发性的酸,碱,盐=>挥发性的酸,碱,盐(2) Positive Ion ( pH 5.0 ; 9 preferred)●Acetic acid●Formic acid●Tri-fluoroacetic acid●Ammonium hydroxide●TEA(3) Post-column addition of acid or base may be used to adjust the pH if the chromatography won't work at the desired pH(4) 溶剂适用性Suitable for ES and APClSuitable for only APCIMethanoIAcetonitriIe ;*WaterEthanol ; Propanol ; lsopropanoI ; ButanoIDMF(1) ; DMSO(1)Acetic Acid ; Formic AcidAcetoneCH2C12 ; CHCI3THFTolueneBenzeneHydrocarbons (e.g Hexane)StyreneCCl4CS2Cyclic Hydrocarbons(e.g Cyclohexane)(5)许多常规的HPLC溶剂适合於API-MS.较好的电喷雾溶剂将在溶液中保持离子.因此,如甲苯这样的溶剂,在溶液中不会保持离子,不能用於电喷雾.虽然水是对离子极好的溶刹,但它的溶剂化能太高,去溶剂困难.(6)常用的LC/MS溶剂一般为高质量的甲醇,乙睛,水和挥发性添加剂,如甲酸,乙酸,甲酸铵和乙酸铵等.如果这些常规溶剂能满足分析的需要,可不考虑其他溶剂.(7)层析类型与离子源适用性ESIAPCIReversed phase*****Normal phase***p.s. Main compatibility problems: ions in solution are favorable for electrospray, but may lead to poor retention in reversed phase. High ionic strength and/or nonvolatile buffers may be hard to electrospray(8)ESI/APCI与HPLC的移动相之正反模式的相容性:(a)电喷雾有利於溶液中的离子.但是反相液相层析条件通常会抑制离子化,增加分子疏水性质.之后添加可用於克服这种类型的不相容性.样品通常挥发性低.(b)电喷雾对正相分离不是很有用,因为在正相移动相中通常不会形成离子.而APCI可处理非极性移动相,非极性样品通常较易挥发,因此正相层析可用於APCI.(c)以凝胶过滤形式的体积排阻层析与电喷雾相匹配.水相移动相和蛋白质样品是很好的匹配.凝胶过滤层析不适合APCI.通常样品不易挥发,而且缓冲液会引起APCI问题.然而,凝胶渗透层析由於移动相为有机性的,不太适合於电喷雾.3. Set up Pump(1)流速(flowrate) :流速就是溶剂沿著管柱流动的速度.保持流动速度为常数对确保精确的保留时间和峰面积测量是很重要的.(2)溶剂(solvent) :设定分析的溶剂组成.可选择一元分析或梯度流洗分析.设定通道B 的百分比为从0到100%的任何值.通道A为剩下的体积100-(%B).当运行反相层析分析时,建议把水相放在通道A.(3)压力界限(pressure limit) :设定压力限制的上限和下限,最高压力限是pump的自行停止的界限,保持分析系统压力避免过大.如果压力低於最低限以下,例如移动相走空以后,pump也将自动停止.(4)停止时间(stop time) :设定一个分析的时间.停止时间后,所有的梯度都会停止,并且pump 参教返回初始值.pump 是一个完整分析系统停止时间的掌握者.(5)驻留时间(post time) :驻留时间是分析结束和下一个分析开始之间的最小时间间隔,可以利用驻留时间在改变移动相组成后平衡Column,例如梯度流洗以后.(6)时间表(time table) :时间表用於建立pump的梯度洗脱程序.pump时间表的值从时间表中定义的终值应随时间线性地变化.4. Set up Injector(1)标准的进样体积为0.1~100μL(标准配置).如果使用洗针功能,指定洗针所用的溶剂瓶号即可.其余参数一般不需要改变.(2)选择Use Injection programs可以按照使用者要求,安排程序进样.(3)如果希望两次进样取样间隔时间,可以选择Optimization选项:(a)Overlap Injection cycle:在前一针样品进行时,就提前把下一针的样品吸入定量瓶中,做好进样准备.要注意一定要改变后面的时间内定值,以保证前一针样品能够顺利进入液相系统,同时保证下一针样品的扩散最小.一般建议该时间选择在上一针样品进行停止之前1~2min.(b)Prefetch Sample Vial:在前一针样品进行时,就提前把下一针的样品抓取到针座上等候,做好进样准备.此时预约的时间要比上种选项要少,但没有样品扩散的风险.此时也要注意一定要改变后面的时间内定值,以保证前一针样品能顺利进入液相系统,一般建议该时间选择在上一针样品进行停止之前1~2min.(4)注意要保证Agilent 1200各个模式的Stop Time和Post Time 的设定要一致,内定为As pump,即在pump的参数设定画面规定这两个时间即可.5. Set up DAD Signals(1) Signals :规定采集层析图所需的参数,要求样品的检测步长Wavelength(Sam.)设在化合物的最大吸收步长处,且大於溶剂的截止步长20nm以上.参考步长Wavelength(Ref)应设在样品没有吸收的地方,且越靠近样品的侦测步长越好.另外,要求BW(Ref)>BW(Sam.)>Slit,其中样品的谱带宽度Band Width(Sam.)应约等於其紫外吸收峰的半峰宽.注意记得保存所需通道的层析图,否则层析数据将不被保存.(2)Spectrum:规定采集吸收光谱时所需的参数.可保存所需张数的光谱图None, Apex + Baselines, Apex+Slopes+Baselines, Ail in Peak, Every 2nd Spectrum或All.若需要进行峰纯度检测或最佳化完全未知的样品检测条件,建议选择All模式.(3)Peakwidth:设定影响层析图的数据采集频率,Peakwidth应略小於层析上最窄的层析峰的半峰宽.数据采集速率太快,则层析图的毛刺过多,数据采集速率太慢,则所采集的数据点过少,造成层析峰变形,无法进行准确定定量B. MS设定条件参考1.电喷雾(ESI)之3个基本步骤: 喷雾及带电→去除溶剂→离子蒸发.ESI之雾化气压力,乾燥气流速及温度取决於流动相组成及流速,如流速越快,含水量越高即需越多乾燥气辅助去除液滴中溶剂.ESI需考虑(1)样品:(a)在溶液中为离子态:儿茶酚胺,硫酸酯共轭物,丁基胺(b)有可诱导电离的化合物:甲醇(c)含杂原子的化合物:氨基甲酸酯类,苯并二氮杂原子类(含O, S, N)(d)溶液中带多电荷:蛋白质,多肽,低聚核甘酸(2)溶液化学参数:(a)流速(b)样品的pKa,溶液pH(c)溶液导电性(3)应避免的样品: 尤其非极性的样品PAHs,PCBs2.化学电离(APCI)之3个基本步骤: 雾化→蒸发液滴→气相电离.即蒸发后再进行离子化,用於可被蒸发之样品,且此过程只产生单电荷离子.APCI需考虑(1)样品(a)分子量和极性中等的化合物AHs, PCBs,脂肪酸,邻苯二甲酸酯类(b)不含酸性和碱性位点的化合物: 酮,酯,醇,醛,碳氢化合物(c)含有杂原子的化合物:脲,氨基甲酸酯等(d)对电喷雾响应不好的样品(2)溶液化学参数(a)较ES对溶液化学作用不灵敏(b)较ES更耐大的流速(c)适用ES不宜的一些溶剂(3)应避免的样品: 在气化过程中热不稳定的化合物3.MS 雾化室(MSD spray chamber)(1) Method: API-ES ; APCI(a)乾燥气流速(drying gas flow, L/min) : 范围0-13即最高限值13 L/min.ESI通常为8-10 L/min;APCI通常为4.(b)喷雾气压力(Nebulizer pressure, psig) :APCI:60 psi;ESI与流速有关,最高限值60 psi.(c)乾燥气温度(drying gas temperature) :与流动相和流速有关,通常为300 ℃以上.水相比较多或高流速时要求较高的乾燥气温度.最高限为350 ℃(d)蒸发温度(Vaporizer temperature)(限於APCI) :与溶剂和流速有关,通常为350 ℃.水或高流速时要求较高的蒸发温度.最高限为500 ℃.(e)毛细管电压(Capillary voltage) : 最高限为6000 V正模式(V) 负模式(V)ESI 4000 3500APCI 4000 4000注: ESI模式负极性时,在高电压时全发生喷针放电.(f)电晕电流(Corona current, μA) (限於APCI) :对正极性: 通常为4 μA;对负极性: 通常为25 μA.(2) Method: MM-ES + APCI 复合源(a)注意charging voltage : 影响ESI区域离子化重要参数.4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)(1) Use MSDMSD将被用作检测器.在standby状态,不会被作为检测器.(2)停止时间(Stop Time): 质谱停止采集的时间.(a)一般设为As pump:按照LC pump中所设的停止时间,(b)若使用者输入时间:当选到指定时间时,MSD数据采集将停止.(3)FlA状态: 选择FlA时,会显示FIA enabled.非FlA时,显示FIA disabled.(4)调整档案(tune file): 指定采集数据时MSD采用那个调整档案里的参数(5)峰宽度(Peak width): 输入预期的层析峰半宽度(用分钟表示).典型的层析峰宽为0.05-0.15 min.不确定时使用较小的值.内定值为0.1 min.(6)循环时间(Cycle time): 完成一次所有活性信号扫描的时间(秒).也可想像层析图上一个采样点的时间.循环时间的计算与所输入峰宽有关.(7)快速扫描(Fast scan):(a)当设定的质谱信号参数(如峰宽,质量范围和步长)会导致采集数据点过少时,软体会提醒改变参数或选择快速扫描方式.(b)如果参数设定不需要快速扫描,即使选择快速扫描也不会被执行.在VL系统中没有这个选项.(c)在最佳化扫描速度时,会损失一些灵ㄧㄥㄣㄚㄚ陌性敏度和分辨率.因为四极柱的离子传输效率较低.Data reconstruction (selectable)可选,在此设定下采集的数据进行重组以提高电荷和多电荷质谱图的分辨率.某些需要快速扫描速度的应用,不一定要重组数据.对於这些应用,不选择数据重组.数据重组时应用一个移动平均过滤器以减少由快速扫描引起的质谱杂讯.(8)时间过滤器(Time Filter): 内定为选择时间过滤器.建议使用时间过滤器.(9)扫描数据存档(Scan Data Storage):(a)建议选择保存压缩数据(Condenced),即棒状质谱图,节省磁碟空间.(b)对多电荷样品使用完全数据(连续质谱图),其它使用压缩数据.(c)Deconvolution只能在完全数据上进行.如果试图在压缩数据或SIM数据上使用Deconvolution,将会产生错误.5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方)(1)极性(Polarity):指定MSD检测离子的极性(positive/negative).必须先进行MSD tune.(2)模式(Mode): 采集质谱数据的方式.(3)扫描(Scan):从高到低指定的质量范围,并且以指定的间隔(步长)检测强度.在过程中这个程序不断重覆.适於定性分析,例如未知物的鉴定,峰纯度或多电荷样品分子量的确定.(4)碎裂器(ramp):适用於Scan模式和定义ramp.不同的质量数离子可应用不同的碎裂电压.(5)时间(Time): 进样后质谱参数开始进行生效的时间(min)如果第一行是非零时间,MSD不会采集,直到这个时间到达.质谱选择阀也会将LC流路送到废液瓶,直到开始数据采集.(6)质量范围(Mass range): MSD扫描的质量范围.范围越大,MSD须扫描得越快.要得到高品质数据,应扫描所需范围.(7)增益(Gain): 增益是MSD信号放大因子,将信号强度电子倍增器的电压相关联,增益5会得到增益为1时的信号强度的5倍.通常,检测器会在较低的增益值对工作即能产生合适的离子强度.高增益值同时会增加噪音,产生较差的信噪比.通过增加增益值来提高EMV电压会缩短电子倍增器的寿命.(8)碎裂器电压(Fragmentor voltage): 设定碎裂电压.当进行一个方法(Method)时,控制碎裂器电压优先是:(a)选择FIA时,包括碎裂电压的FIA表;(b)当选择碎裂器ramp时,碎裂器ramp表(FIA未选择);(c)如果以上的都没有选择时,参考下列信号设定表.(9)阀值(Threshold): 阀值是强度值.只有强度等於或大於这个值的数据点才被保留在每个扫描的质谱中.内定值150.(10)步长(Step size): 步长是设定扫描数据点之间步幅的大小.这个参数影响扫描速率.典型的值是0.1,范围为0.05到0.4.Fragmentor值与化合物性质有关: 不同化合物使用不同的Fragmemtor值CompoundMax. Mol. Ion2nd. M/z >50%Acid Red 4 (-) 100 130Alprazolam (+) 100 140Caffeine (+) 70 100Methamphetamine (+) <50 70Nitrophenol (-) 70 100Quinine (+) 90 130Quinine (++) 50 60Reserpine (+) 130 170Salbutamol (+) 200注: 最佳化碎裂电压: 表中数据表示不同化合物获得最强的准分子离子和第一个碎裂离子达到其50%强度的碎裂器电压值.每个化合物均通过FlA模式在碎裂电压50到200 V范围内进行分析的.6.选择离子检测(SlM)/ 扫描(scan)模式(1)Scan采集在特定范围中每个质量上的数据.对定性分析通常采用scan模式采集,例如确定样品的分子量或纯度.(2)SlM只采集预先设定离子的数据.此采集方式具灵敏度和专一性.定量分析通常选择SlM 模式.Greater sensitivityBetter peak shapeTrace levels easily detected in complex matricesUsed for routine quantificationUseful when precise ion ratios are desired(a)SlM参数: SlM有三个可用自订的参数# of ionsm/z of each ionDwell time(b)每组可检测30个离子,每次采集可分50组.(c)每组检测最少数目的离子可获得最大的信噪比和准确度.(d)驻留时间(Dwell Time)是对每个离子检测的时间段.该时间取决於峰宽选择(17+2cycles/peak).S/N正比於Dwell Time.(e)可以设定同组中每个离子驻留相同时间或设定每个离子相对驻留时间:*组内(group)为同时SIM的离子,组间为不同对SIM的离子.*组内SIM的离子越多,每个离子的驻留时间就越少.*操作者可根据层析峰的分离情况将不同离子设为组内,或组间SIM.*驻留时间是用於采集每个离子的时间.驻留时间与MSD参数对话框中设定的峰宽度值有关系.软体会根据峰宽度值,然后根据每个峰要有17+2个循环的需要以确定驻留时间.除非使用者指定相对的驻留时间,否则驻留时间会在组内的离子间平均分配.(3)选择SlM 离子(a)定量离子:该离子的响应用於计算待测物的含量.(b)限定离子:该离子的响应值与定量离子响应值之比值用来确认待测物质化合物,以避免假检出.(c)选择相对强度较高的离子可以提高灵敏度.(d)选择质量数高的离子可以避免干扰.(e)选择唯一性高的离子.(f)尽量避免选择基质或背景中存在的离子.(g)如果可能,每个化合物选择多个离子.离子间的比例可以帮助判别化合物,特别是同位素族.(h)对於SIM定量,可以对每个层析峰选择一个定量离子.这个离子应该峰高且唯一.不要选择在基体或背景中相同的m/z.(i)为确定层析峰,选择一或两个限定离子.这些离子也应该峰高且唯一.在LC/MSD分析中,离子的出现和峰高度,缓冲液和碎裂器相关.(4)选择定量/限定离子(a)应用精确质量,不要用名义质量(例如195.2而不用195).(b)为得到最佳效果,用动态校正,即选择如括弧所示的样品质量(195.0,195.1,195.2,195.3,195.4)以选择响应值最佳的离子.(c)为长期的效果,检测前要对质量轴进行校正.(5)定量方法建立首先要扫描采样以确定在SIM分析中所要使用的离子.使用扫描采样数据,得到谱图列表展示有一位近似值的精确质量并输入到SIM表中.使用者应使用列表中的质量,例如195.2,而不是名义上的质量195.如果所选择的SlM质量偏差0.3daltons,则灵敏度会有70%的损失.另一方面,找到SlM分析的最佳m/z,要避免所有离子的SlM实验产生一位近似值.这就是所谓的动态调整.(6)动态SIM校正动态SIM校正可以获得最佳的SIM灵敏度.做SIM 试验:(a)以0.1 dalton为间隔采集多个质量例如:Caffeine 195.2 : 195.0 ; 195.1 ; 195.2 ; 195.3 ; 195.4(b)积分SIM数据并且选出响应值最大的离子作为定量离子(c)进行动态调整,此例子中,全扫描质谱图在195.2 daltons处有离子.(d)咖啡因的SIM实验将包括一组具有五个离子:195.0,195.1,195.2,195.3和195.4 daltons.评估各质量的离子EIC 积分结果,或直接看质谱图以找到最大强度的离子.这就是SIM定量的最佳离子.C. MS说明与解析:1.四极杆质量分析器有两种扫描方式:(1)全扫描方式(scan) : 主要用於定性分析,未知化合物的鉴定;(2)选择离子监测(SIM) : 主要用於已知化合物的定量分析.2.质谱常用术语1.分子离子(molecular ion)自由基(radical)离子M.+.很活泼,易碎裂而产生广义的碎片离子.2.准分子离子*(quasi-molecular ion)由软电离技术产生的质子或其他阳离子加合离子以及去质子化或其他阴离子加合离子.3.碎片离子(fragment ion)电离后具有过剩内能的分子离子以多种方式裂解生成碎片离子.4.奇电子离子(odd-electron ion, OE);偶电子离子(even-eIectron ion, EE)OE含未配对电子,有较高的反应(碎裂)活性,易生成碎片离子.5.多电荷离子(multiply-charged ion)6.同位素离子(isotopic ion)3.质谱图相关概念(1)总离子层析图(Total Ion Chromatogram, TIC)(2)质谱图(Mass Spectrum, MS)(3)选择离子监测图(Selected Ion Monitor, SlM)(4)萃取离子层析图(Extract Ion Chromatogram, EIC)(1)总离子层析图(Total Ion Chromatogram, TIC)将质谱图上每一个离子的强度的总合对应扫描时间作图产生的.TIC层析图上每一个采样点都对应一张质谱图.(2)准分子离子当用大气压电离技术分析小分子时,通常在质谱中主要的峰是质子化准分子离子.例如苯基保泰松的实际质量308,在质谱图中其基峰即最大强度峰是准分子离子[M+H]+峰,m/z为309.(3)萃取离子层析图(EIC) : 可以(a)提高S/N去除背景(b)分离共流出峰(c)主要用於:寻找目标峰,准确定量注意:EIC是在数据采集后分析时生成的;而SIM是实际信号.4. LC-API/CID/MS :(1)通过调节毛细管出口电压,在毛细管出口处可发生碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation, CID)而产生碎片.利用碎片信息,有助於定性;利用碎片离子定量,可提高方法的专属性.(2)范例:甘油三酸脂的碎裂电压75V可得谱图中m/z 684.65呈现准分子离子峰[M+NH4]+.当碎裂电压升高到175V,可用碎片离子m/z 467或439表示.(3)API是一种相对的软电离技术,产生的主要是准分子离子.CID是用中性气体分子去碰撞离子产生碎片的过程,对定性分析和定量分析都很有用.(4)CID可以通过选择离子传输毛细管出口和第一级分离器之间的离子能量来控制.离子能量可以通过改变软体(chemstation)中所谓的碎裂参数来改变.5. MS解析规则与条件说明(1) [M+H]+离子的氮规则分子量为奇数[M+H]+ 为偶数的离子有奇数个N分子量为偶数[M+H]+ 为奇数的离子有偶数个N或不含N例1. m/z 300的[M+H] + 离子: mw = 299 ; 即化合物一定有奇数个氮例2. m/z 301的[M+H] + 离子: mw = 300 ; 即含有偶数个氮(0,2,4….)(2)API质谱图解释电喷雾和APCI是可提供分子量信息的软电离技术.检测到的离子种类与溶剂添加剂和分析所用的条件相关.正离子检测负离子检测-[M+H]+ 酸性条件-[M+Na]+ , [M+K]+ (有盐时)-[M+NH4]+ 有铵盐缓冲溶液-[M+X]+, x=溶剂或缓冲溶液中的阳离子-[2M+H]+在高浓度时形成的二聚体-[M+H+S]+ 溶剂添加剂-[M+H]- 碱性条件-[M+X]- , x=溶剂或缓冲溶液中的阴离子-[M-H+S]- 溶剂添加剂(3)样品的储存,准备,移动相和添加剂都将影响最后结果.当建立一个新方法时要注意这些因素.(4)CID (Collision-Induced Dissociation )通过与中性气体分子碰撞将能量传递给离子产生碎片的过程.能量传递足以导致断键和所选离子重排.对定性分析和定量分析都很有用.定性提供有关分子的结构信息.定量特性由限定离子的存在而增强.70年代初McLafferty (JACS,95,3886,1973)证明ClD 使键断开和离子重排,产生离子代表中性分子的结构.结构解析:API过程中,准分子离子以偶电子离子形式出现.通过CID合产生碎片,碎裂过程如下:ABCD+→ABC+ + D (中性碎片)电荷保留在质子亲和势较高的碎片上(5)ClD 质谱图解析: 常见中性损失( Even LOSS)(M+X)+-18水(M+X)+-H2O(M+X) +-20氟化氢(M+X)+-HF(M+X) +-28一氧化碳或乙烯(M+X)+-CO or (M+X) +-C2H4(M+X) +-30甲醛(M+X)+-H2CO(M+X) +-31甲胺(M+X)+-CH3NH2(M+X) +-32甲醇(M+X)+-CH3OH(M+X) +-36氯化氢(M+X)+-HCI(M+X) +-44二氧化碳(M+X)+-CO2(M+X) +-46二氧化氮(M+X)+-NO2(M+X) +-60乙酸(M+X)+-CH3CO2H(M+X) +-90硅醇(M+X)+-HO-Si-(CH3)3(b)6. API电离步骤及过程:(c)(1)溶液中电离(样品pKa,溶液pH)→(2)喷雾(表面张力及黏度,气动辅助)→(3)去溶剂(乾燥气温度及流速,热容量Hvap)→(4)离子从溶液中解析(溶解能)→(5)气相中的离子反应(质子亲合力,电荷交换)(d)(1)当分析物在溶液中以离子存在时得到最佳的电喷雾灵敏度(e)对中性分子,离子相互作用比非离子相互作用大103至104倍(例如:凡得瓦力,氧键).因此分析物离子可以克服液滴的溶解能,从带电液滴中解析出来.(f)(2)在溶液中如何产生离子(g)(a)酸/碱化学性质: M - NH2 + 酸→ [M-NH3]+ +酸-(h)M - COOH + 碱→ [MCOO]- + 碱+(i)(b)螯合(对类似糖的中性物质): M.+ Na+ [M + Na]+ (碱金属,如20 M乙酸钠)(j)(c)衍生化: 形成离子或酸/碱产物(k)当分析物溶解在酸或碱之极性溶剂中时,可被离子化或具有强偶极距.对於电离的分析物,ESI通常简单且具有高灵敏度.不存在其它离子-离子相互作用干扰,离子在喷雾前已经存在於溶液中.在喷雾中这些离子易於从液滴中蒸发出来,得到较高的分析物离子强度.(l)形成强偶极距但没有被电离的分析物也可分析.喷雾室中的强电极场驱动离子化过程.这些电场促使喷雾液滴带电荷,使液滴表面引起分析物分子离子化.通过使用特定的化学物质的交互作用,这些分析物也可被化学电离.(m)(3)对电喷雾使用典型缓冲液产生离子的问题- 离子对的形成(n)(a)对正离子检测,由於离子对的形成,使溶液中或气相中的离子中和!(o)[M + H]+ + A- [M + H + A]o ;(p)A = B, S, P : 有利於中性样品; A = 甲酸盐,乙酸盐: 有利於带电物质(q)*离子对强度: B,S,P >三氟乙酸>乙酸盐,甲酸盐(B, S, P) = 硼酸盐,硫酸盐,磷酸盐(r)(b)对负离子检测,由於离子对形成,使溶液或气相中离子的中和!(s)[M-H]- + C+ [M-H + C]0 ; C = Na,K,Li (中性产品); C = NH4+(带电物质)(t)(4)气相中的离子反应(u)(a)通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会产生质子转移和电荷交换反应.这个高压区允许发生1000次离子/分子反应.(v)(b)质子转移:(w)与HPLC添加剂相比,如:氨,三乙胺(质子亲合力分别为206和232 kcal/mole),样品具有较低质子亲和力的会失去一个质子,变成中性或形成复合离子如[M+NH4]+.(x)(c)溶液碱度在气相中会导致分析物离子的去质子化,致使分析物没有电喷雾信号.添加剂如三乙胺这样强气相碱的使用,会导致[M+H]+离子损失.添加剂(乙酸铵,甲酸铵,乙酸,甲酸和氢氧化氨)的使用会减少这些反应.(y)(5)比较(z)电喷雾电离源(ESI)(aa)大气压化学电离源(APCI)(bb)离子在溶液中已生成(cc)离子在气态条件中生成(dd)化合物无需具有挥发性(ee)化合物需具有一定的挥发性(ff)是分析热不稳定化合物的首选方法(gg)化合物必需是稳定的(hh)生成单电荷离子外亦可生成多电荷离子(ii)只生成单电荷离子(jj)7. ESI 及APCI 最佳化条件(kk)(1)APC-MS添加剂(ll)(a)调整PH : 使用乙酸,甲酸,TFA,氨氧化胺(mm)(b)一般的缓冲液/离子配对试剂:(nn)乙酸铵/甲酸铵; 三氟乙酸(TFA) ; 七氟丁酸(HFBA) ;(oo)四乙基或四丁基氢氧化铵(TBAH)(pp)(c)阳离子化试剂: 20-50 M的乙酸钠或乙酸钾(qq)(d)一般考虑:(rr)挥发性(污染喷雾室,堵塞喷嘴)(ss)导电性(对离子气化过程减少小液滴的形成)(tt)离子配对(进入气相时中和预带电离子)(uu)(e)不能使用在HPLC中常使用的磷酸盐,硫酸盐或硼酸盐(vv)(f)在APl-ES中影响添加剂选择的主要因素是离子配对和挥发性.(ww)(g)对APCI添加剂选择的主要因素是挥发性.(xx)8. 将现有的LC方法改编为LC/API-MS方法(yy)(1)溶剂:(zz)(a)非挥发性缓冲盐=>挥发性缓冲盐(aaa)(b)浓度<10 mM(对於ES)或<100 mM(对於APCI)(bbb)用醋酸鞍,甲酸,三氟乙酸(TFA),七氟丁酸(TFBA),羟基四丁基胺取代磷酸盐,硫酸盐和硼酸盐.(Formic acid, acetic acid, TFA, ammonium hydroxide)(ccc)如果必须使用非挥发性缓冲盐,使用仅阳离子或阴离子部分不挥发性缓冲盐,例如用醋酸钠而不用磷酸钠.(ddd)(c)挥发性离子对试剂可以使用.(eee)(2)样品制备: 通常样品制备或没有样品制备会严重影响API-。
LC-MS操作步骤
液质联用使用流程一、开机步骤1.质谱开机步骤1）检查氮气和氩气，并打开主阀。
2）检查机械泵泵油的水平线是否在窗口的1/2～2/3 之间。
3）打开UPS电源，打开计算机和离子阱质谱仪下方的主机电源。
4）启动trapcontrol 软件，待真空度达到2*10-5mbar 以下，按《离子阱质谱仪使用流程》正常操作。
（如果长时间关机或更换He 钢瓶，在离子阱控制画面，选择菜单：Options > Vacuum System…，选择Flush Helium Line 两次）二、液相开机步骤1）检查流动相并补加好，确保柱子装的是3.5µm 2.1 x 50mm的。
2）打开计算机，依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源，等待仪器自检过后方可操作。
3）打开变色龙的软件，对泵进行洗泵和排气。
4）设定各部参数，让仪器平衡一段时间待基线平稳三、液质联用使用步骤1. 质谱方法的建立1）单击桌面图标或者通过程序目录启动trapcontrol 软件；Start - Programs - Bruker Daltonics - esquireControl 软件可能要求输入操作人员的姓名。
2）选择软件中质谱仪处于操作状态<Operate>3）参数调节，初学者建议采用Tune -> Smart 模式，调节下图蓝色标识部分。
A 雾化气、干燥气流量和温度，建议以下列值为基准调节：Nebulizer5 psi - 15 psi ，Dry Gas 5 l/min ，Dry Temp 300 °C 。
B 设置正负离子模式，或者正负离子交替模式。
C 选择合适的质量范围，如对于小分子化合物，设置Scan 100to 1500 m/z。
D 设置目标质荷比：在Smart 模式下，只需要将Target Mass 设置在目标化合物附近即可。
也可以选中某一个信号，右击，选择Run SPS，优化这个信号相关参数。
LC-MS解析基础以及常见问题剖析
LC-MS解析基础以及常见问题剖析LCMS是有机合成中重要的分析工具，解析LCMS谱图也是一项基本技能。
LCMS基本原理和特性1）LCMS的特性：是HPLC和MS的结合，有两者的功能，有没有两者精确。
2）流动相方法：常见0-30，0-60，10-80，30-90四种方法，0，10，30都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流动相极性越小，出峰越靠前。
3）正离子源适用于碱性化合物：含氮化合物更容易粘附氢正离子，在正离子源中容易出分子离子峰。
负离子源适合酸性化合物：酸性化合物更容易轰击掉氢正离子，如酸，酚类化合物。
看LCMS步骤1）先看MS部分，看有没有所要离子峰，并且要看清楚该化合物是否有MS信号，是否掩盖周围的峰。
2）再看HPLC部分，看含量有多少，并且要看清楚该化合物是否有强的HPLC信号，是否掩盖周围的峰。
3）两者结合起来看，推测反应进行的程度和反应产生的杂质。
常见加合离子峰1）正离子模式：[M+Na]+ = [M+23]+加钠离子；[M+K]+ = [M+39]+加钾离子；[M+NH4]+ = [M+18]+加铵离子；[M+H+H2O]+ = [M+19]+加水；[M+X]+这里X是指溶剂缓冲液中的阳离子；如加硝酸根：[M+NO2]+ = [M+46]+[M+H+Solvent]+溶剂加合峰，如[M+H+CH3CN]+= [M+42]+是CH3CN加合离子，[M+H+CH3OH]+ = [M+33]+是CH3OH加合离子；2）负离子模式[M-H]- = [M-1]-减氢负离子[M+35Cl]- = [M+35]-加氯负离子[M+37Cl]- = [M+37]-加氯同位素负离子[M+HCOO]- = [M+45]-加甲酸根负离子[M+CH3COO]- = [M+59]-加乙酸根负离子[M+CF3COO]- = [M+113]-加三氟乙酸根负离子减峰M-56(脱叔丁基）和M-100（脱Boc），M-16（脱NH3)和M-17（脱水）以及M+2/2（比较常见），其他少见。
质谱(lc-ms)方法开发指南
质谱（LC-MS）方法开发指南一、概述质谱（LC-MS）是一种强大的分析技术，广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
然而，开发一个可靠、灵敏的LC-MS方法并非易事，需要仔细的实验设计和严谨的操作。
本文旨在提供一份LC-MS方法开发的指南，帮助研究人员高效地完成LC-MS方法的开发工作。
二、样品准备1. 样品的选择：LC-MS分析的样品应具有一定的纯度和稳定性，避免样品中含有大量的杂质或不稳定的成分。
2. 样品的前处理：对于复杂样品，需要进行适当的前处理，如固相萃取、液-液萃取等，以提高分析的准确性和灵敏度。
三、色谱条件的选择1. 色谱柱的选择：根据样品性质和分析需求选择合适的色谱柱，如C18柱、C8柱等。
2. 流动相的选择：优化流动相的组成、pH值和流速，以提高分离效果和信号强度。
3. 温度控制：对于一些温敏感化合物，需要对色谱柱进行恒温控制，以避免样品分解或形成不稳定的反应物。
四、质谱条件的选择1. 离子源的选取：根据样品的性质选择合适的离子源，如电喷雾离子源（ESI）或化学电离源（APCI）等。
2. 探测器的选择：选择适当的探测器，如飞行时间质谱仪（TOF-MS）、三重四极杆质谱仪（Q-TOF）、四极杆质谱仪等。
3. 离子监测条件的优化：优化离子源的参数和质子化/去质子化离子片段的监测条件，以获得清晰的质谱图谱。
五、方法验证1. 灵敏度的验证：进行样品的定量限、检出限和线性范围的验证，以确保LC-MS方法的灵敏度满足分析要求。
2. 选择性的验证：对可能干扰的成分进行测试，验证LC-MS方法的选择性和特异性。
3. 精密度和准确度的验证：进行重复性和回收率的验证，评估LC-MS 方法的精密度和准确度。
六、实验操作的注意事项1. 仪器的维护和校准：定期对LC-MS仪器进行维护和校准，保证仪器的稳定性和准确性。
2. 样品的处理和储存：严格按照操作规程对样品进行处理和储存，避免样品受到污染或降解。
液相色谱_质谱(LC_MS)联用的原理和应用
离子峰称作基峰. 总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；
多电荷离子；同位素离子
总离子流图:
在选定的质量范围内，所有离子强度的 总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC图.
高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的 元素组成从而推出分子式
低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:
(3)峰强度与结构的关系
丰度大反映离子结构稳定 在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子
外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力 越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本 一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。
(3) 尽可能判断出分子离子。
(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子 所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1， M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H， CH3，H2O，HF，OCH3......
(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照， 或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。
EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。
CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。
FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。
FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。
不同类型有机物有不同的裂解方式 相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量
数的差异
需要经验记忆。
LC-MS液质联用经验手册
LC/MS液质联用经验手册液质使用经验与禁忌一、酸性物质适合做负离子检测，所以流动相偏碱性较合适，促使其解离，碱性物质适合做正离子检测，流动相中适当的加入酸，促使其形成正离子，流动相中适当加一些醋酸钠（或者醋酸铵），可形成加钠的正离子或加铵的正离子。
液质分析中推荐使用的流动相和添加剂推荐使用不使用/尽量不使用有机溶剂反相：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷正相：吐仑、己烷、苯、环己烷、四氯化碳四氢呋喃缓冲液乙酸铵、甲酸铵磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐酸乙酸、甲酸、三氟乙酸（正离子）硫酸、高氯酸、磷酸、盐酸、磺酸碱氨水季铵、强碱、三乙胺其它清洁剂、表面活性剂、离子对试剂、不挥发盐二、糖苷类的物质在做FAB和ESI+时，[M+Na]峰往往比[M+H]峰要强，此为经验，原因只是推测可能和天然产物的提取过程有关；盐类化合物如盐酸盐、硫酸盐在质谱中酸的部分一般不会出现；二羧酸盐（esi 负离子模式）除了分子离子峰外，会出现连续掉44的两个峰，为失去羧酸根的离子，这三个峰非常特征，但是会受锥孔电压的影响，调低电压谱图会更漂亮。
三、胺类物质做ESI质谱时要注意进样量要少，因为很容易离子化，不易冲洗干净，会影响后面样品的测定。
像三乙胺在液质联用时不能用于调节流动相pH值。
若不慎引入三乙胺，在正离子检测时总会出现很强的102峰（三乙胺的[M+H]）。
四、质谱用水一般用娃哈哈纯净水之类的就很好；质谱用甲醇和乙腈，换用了很多品牌，发现Merck的还是稍微好一些；Finnigan用的氮气不一定要用到液氮瓶，用普通的钢瓶气就可以了，可能还省钱些；建议大家买一个好一点的手电筒和一个放大镜，手电筒用来看源里面，放大镜看你割的毛细管平整。
五、质谱的基线其实跟液相的紫外检测器和荧光检测器一样，基线高的原因不外乎内部和外部的原因。
①你选择的流动相在质谱的响应比较高，比如水相比较多的时候，噪音比较大些；还有如果盐含量比较大的时候，噪音更大些。
液相色谱质谱联用的原理
多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子
质量分析器
◆ 质量分析器是质谱仪旳关键, 质量分析器旳作用 是将离子源产生旳离子按m/z顺序分开并排列。
◆ 不同类型旳质量分析器构成不同类型旳质谱仪。
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单双聚焦质谱仪体积大； 色谱-质谱联用仪器旳发展及仪器小型化（台式）需要 体积小旳质量分析器：
四极杆质量分析器 飞行时间质量分析器 离子阱质量分析器
体积小，操作简朴； 辨别率中档；
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四极杆质量分析器
Electron Beam Sample in
Ion Beam
A
C
+
B
四极杆质谱构造简朴，价廉，体积小，易操作，扫描速
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离子阱质量分析器
特定m/z离子在阱内一 定轨道上稳定旋转，变化 端电极电压，不同m/z离子 飞出阱到达检测器；
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检测系统
质量分析器分离并加以聚焦旳离子束， 按m/z旳大小依次经过狭缝，到达搜集器, 经接受放大后被统计。
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质谱仪旳检测主要使用电子倍增器，也有旳使用光 电倍增管。由倍增器出来旳电信号被送入计算机储存， 这些信号经计算机处理后能够得到色谱图，质谱图及其 他多种信息。
正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲 酸对样品加以酸化。样品中具有仲氨或叔氨时 可优先考虑使用正离子模式。
负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三 乙胺对样品进行碱化。样品中具有较多旳强伏 电性基团，如含氯、含溴和多种羟基时可尝试 使用负离子模式。
3.流动相旳选择
常用旳流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同百分 比旳混合物以及某些易挥发盐旳缓冲液，如甲酸 铵、乙酸铵等，还能够加入易挥发酸碱如甲酸、 乙酸和氨水等调整pH值。
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LC-MS流动相的选择
液质流动相怎么选择好！质谱方法做好以后，怎么选流动相，查文献，看看是否有人做过相同或类似化合物的HPLC.
看结构，极性大小，溶解性，对酸碱的敏感性等等。
大体上有机相是乙腈，甲醇，水相是甲酸水，乙酸水，甲醇水或者加点乙酸铵等。
其它的就用得少了，但具体该怎么选择。
特别是酸的浓度该怎么选？
如果是负离子，酸要尽量少用，尽管有酸对分离有利。
如果是正离子，酸可以稍多，看峰型。
酸的浓度一般不要超过0.1%
1.你的化合物质谱条件是（+），则水相可加甲酸，乙酸，一般0.1%，也可以0.2%，你可以是条件，我的原则是能浓度低就不要浓度高，看的怎么做了。
（-），不要用酸，会有抑制。
2. 液相分离效果，你可以用不同的有机相：水相比例，是分离效果好就ok。
2. 你的uv最佳吸收是多少？？若离200nm很近，建议有机相用乙腈。
4.重要的是，水相不加任何物质就可以出峰很好，建议不要加其他的。
液质联用所用的流动相，不能用不挥发性的物质，如：磷酸盐缓冲液等，常用甲酸盐，乙酸盐等易挥发的物质用作缓冲盐的首选。
在做液质联用测定生物样品时，若选择M H峰可在流动相中加入一些添加剂提供H离子，如甲酸等，一般准分子离子峰较稳定。
液质联用的流动相要求使用挥发性的酸碱盐，常用的如下：
酸---甲酸、乙酸（＜2.0%），三氟醋酸（≤0.5%）
碱---甲胺、乙胺、三乙胺（＜1.0%）
盐---醋酸铵（10-5mmol/L）
在做液质联用测定生物样品时，若选择M+H峰可在流动相中加入一些添加剂提供H离子，如甲酸等，一般准分子离子峰较稳定。
有人认为用M+Na峰时离子不稳定，大家认为选M+Na峰时是不是也应该在流动相中添加一些钠离子，如甲酸钠，醋酸钠等来增加稳定性？战友们有没有选用过M+Na来测定某种药物在组织或血浆中的浓度，。