第11章免疫分析 ppt课件
合集下载
免疫学检测技术的原理分析免疫学教材课件
免疫学检测技术的原理分 析免疫学教材课件
免疫学检测技术在疾病诊断、治疗及药物研发中具有广泛应用。本课件将介 绍其工作原理和应用，以及其优势和限制，以及如何使用本教材。
免疫学检测技术的概述
免疫学检测技术是应用于检测体液和细胞中抗原-抗体反应的技术。它们允许对诊断、预防和治疗疾病的免疫反应进 行研究。
免疫免疫性技术的应用
免疫免疫性技术利用T细胞和B细胞等免疫细胞的高度特异性来检测和研究有关免疫系统的复杂反应。
1
应用
流式细胞术，蛋白质微阵列。
2
蛋白质微阵列
是一种新型的免疫学技术，可快速，同时检测大量蛋白质。通过识别特定的抗体-抗原结合，可以确 定已标记的分子的存在和浓度。
3
流式细胞术
用于确定特定细胞的表面蛋白和内部细胞因子，并可用于诊断疾病。
工作原理
检测抗原或抗体的存在或活性，以确定某种疾病的 存在或发展过程中的免疫反应。
分类
免疫法理方法和免疫免疫性方法，包括酶免疫分析、 放射免疫分析和荧光免疫分析等。
应用
用于检测病毒、细菌、真菌和其他微生物感染，肿 瘤标志物，自身免疫疾病和输血等。
优势和限制
高度灵敏，可靠和快速，但也可能造成假阴性和假 阳性结果。
荧光免疫分析(FLISA)的优势和应用
FLISA是一种荧光标记免疫检测技术，其应用广泛且灵敏 。与ELISA类似，FLISA利用二抗或标记抗体检测抗原或抗体 的存在和浓度。
优势
灵敏和高度特异性；快速且易于自动化，具有高通量。
应用
FLISA用于检测肿瘤标志物、细菌、病毒和各种生物分 子的存在和浓度。
酶免疫分析(ELISAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的原理和优势
ELISA是一种常用的免疫学检测技术，其工作原理是通过将抗原-抗体体系与标记酶和底物反应，从而检测 抗原或抗体的存在或浓度。
免疫学检测技术在疾病诊断、治疗及药物研发中具有广泛应用。本课件将介 绍其工作原理和应用，以及其优势和限制，以及如何使用本教材。
免疫学检测技术的概述
免疫学检测技术是应用于检测体液和细胞中抗原-抗体反应的技术。它们允许对诊断、预防和治疗疾病的免疫反应进 行研究。
免疫免疫性技术的应用
免疫免疫性技术利用T细胞和B细胞等免疫细胞的高度特异性来检测和研究有关免疫系统的复杂反应。
1
应用
流式细胞术，蛋白质微阵列。
2
蛋白质微阵列
是一种新型的免疫学技术，可快速，同时检测大量蛋白质。通过识别特定的抗体-抗原结合，可以确 定已标记的分子的存在和浓度。
3
流式细胞术
用于确定特定细胞的表面蛋白和内部细胞因子，并可用于诊断疾病。
工作原理
检测抗原或抗体的存在或活性，以确定某种疾病的 存在或发展过程中的免疫反应。
分类
免疫法理方法和免疫免疫性方法，包括酶免疫分析、 放射免疫分析和荧光免疫分析等。
应用
用于检测病毒、细菌、真菌和其他微生物感染，肿 瘤标志物，自身免疫疾病和输血等。
优势和限制
高度灵敏，可靠和快速，但也可能造成假阴性和假 阳性结果。
荧光免疫分析(FLISA)的优势和应用
FLISA是一种荧光标记免疫检测技术，其应用广泛且灵敏 。与ELISA类似，FLISA利用二抗或标记抗体检测抗原或抗体 的存在和浓度。
优势
灵敏和高度特异性；快速且易于自动化，具有高通量。
应用
FLISA用于检测肿瘤标志物、细菌、病毒和各种生物分 子的存在和浓度。
酶免疫分析(ELISAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的原理和优势
ELISA是一种常用的免疫学检测技术，其工作原理是通过将抗原-抗体体系与标记酶和底物反应，从而检测 抗原或抗体的存在或浓度。
第十一章-免疫缺陷ppt课件
（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）以来， 获得性免疫缺陷的重要性已远远超出了医学领域。
第一节 免疫缺陷病的分类
免疫缺陷病分为先天性或原发性免疫缺陷病和后天的或 获得性免疫缺陷病两大类。 • 原发性免疫缺陷病 • 继发性免疫缺陷病
一、原发性免疫缺陷病 • 该类免疫缺陷病是免疫系统先天性发育不全所致，根据所
• 此外，亚洲地区，特别是南亚地区的艾滋病感染率也呈上升趋势。 亚洲地区的艾滋病流行情况在国与国之间和一国内部不同地区之 间的差别很大。柬埔寨、缅甸和泰国15岁至49岁的人中艾滋病感 染率超过1％。到2000年底，东亚和太平洋地区的成年人和儿童艾 滋病病毒感染者的数量为60万，南亚和东南亚地区为580万。印度 是南亚和东南亚地区感染艾滋病病毒人数最多的国家，约占这一 地区总数的三分之二。
免疫缺陷病特征—— 感染
• 对各种感染的易感性增加是免疫缺陷最主要、最常见和最 严重的表现和后果，感染也是患者死亡的主要原因。
• 感染的性质主要取决于免疫缺陷的类型，如体液免疫、吞 噬细胞和补体缺陷时的感染主要由化脓性脑膜炎和脓皮病 等。
• 细胞免疫缺陷时的感染主要由病毒、真菌、胞内寄生菌和 原虫等引起。
原发性免疫缺陷病
• 吞噬细胞缺陷病 包括吞噬细胞粘附于血管内皮、通过组织移行至炎症
部位、吞噬已调理的颗粒和在胞内杀死摄入的微生物四个 步骤。 • 补体系统缺陷病
二、继发性免疫缺陷病
造成继发性免疫缺陷的原因很多很复杂，除人类免疫 缺陷病毒（人免疫缺陷病毒, HIV）所致的爱滋病外，更 常见的继发性免疫缺陷从病原学分析可归成两类： • 其它疾病过程中合并的免疫抑制 • 因治疗其它疾病而合并的免疫缺陷
基因的转录 调节病毒mRNA的表达，为gag和env基
第一节 免疫缺陷病的分类
免疫缺陷病分为先天性或原发性免疫缺陷病和后天的或 获得性免疫缺陷病两大类。 • 原发性免疫缺陷病 • 继发性免疫缺陷病
一、原发性免疫缺陷病 • 该类免疫缺陷病是免疫系统先天性发育不全所致，根据所
• 此外，亚洲地区，特别是南亚地区的艾滋病感染率也呈上升趋势。 亚洲地区的艾滋病流行情况在国与国之间和一国内部不同地区之 间的差别很大。柬埔寨、缅甸和泰国15岁至49岁的人中艾滋病感 染率超过1％。到2000年底，东亚和太平洋地区的成年人和儿童艾 滋病病毒感染者的数量为60万，南亚和东南亚地区为580万。印度 是南亚和东南亚地区感染艾滋病病毒人数最多的国家，约占这一 地区总数的三分之二。
免疫缺陷病特征—— 感染
• 对各种感染的易感性增加是免疫缺陷最主要、最常见和最 严重的表现和后果，感染也是患者死亡的主要原因。
• 感染的性质主要取决于免疫缺陷的类型，如体液免疫、吞 噬细胞和补体缺陷时的感染主要由化脓性脑膜炎和脓皮病 等。
• 细胞免疫缺陷时的感染主要由病毒、真菌、胞内寄生菌和 原虫等引起。
原发性免疫缺陷病
• 吞噬细胞缺陷病 包括吞噬细胞粘附于血管内皮、通过组织移行至炎症
部位、吞噬已调理的颗粒和在胞内杀死摄入的微生物四个 步骤。 • 补体系统缺陷病
二、继发性免疫缺陷病
造成继发性免疫缺陷的原因很多很复杂，除人类免疫 缺陷病毒（人免疫缺陷病毒, HIV）所致的爱滋病外，更 常见的继发性免疫缺陷从病原学分析可归成两类： • 其它疾病过程中合并的免疫抑制 • 因治疗其它疾病而合并的免疫缺陷
基因的转录 调节病毒mRNA的表达，为gag和env基
《化学发光免疫分析》课件
内分泌疾病诊断
在内分泌疾病的诊断中，化学发光免疫分析可用于检测激素、维生素 D等，有助于评估患者的内分泌功能状态。
在药物研发中的应用
药效学研究
化学发光免疫分析可用于研究药物对生物体的作用机制和效果， 为新药研发提供重要的药效学数据。
药物代谢动力学研究
通过化学发光免疫分析技术，可以研究药物在体内的吸收、分布、 代谢和排泄过程，为新药研发提供药物代谢动力学数据。
04
化学发光免疫分析的优缺 点
优点
高灵敏度
化学发光免疫分析具有较高的灵敏度， 能够检测到极低浓度的目标物质，如肿
瘤标志物、激素等。
稳定性好
化学发光标记物在长时间内保持稳定 ，不易降解，提高了检测的可靠性。
宽线性范围
该方法具有较宽的线性范围，能够检 测到目标物质在较大浓度范围内的变 化。
自动化程度高
特点
高灵敏度、高特异性、低背景干扰、 操作简便、可实现自动化检测等。
历史与发展
1 2 3
起源
20世纪70年代，随着酶标记技术的发展，研究 者开始探索利用化学发光反应进行免疫分析。
发展历程
经过几十年的研究和发展，化学发光免疫分析技 术不断完善，成为一种成熟且应用广泛的免疫分 析方法。
最新进展
新型的化学发光标记物和检测系统不断涌现，提 高了检测的灵敏度和特异性，拓展了应用范围。
在生物医学研究中的应用
生物标志物检测
基因表达分析
化学发光免疫分析可用于检测生物体 中的各种生物标志物，如激素、细胞 因子、生长因子等，有助于研究生物 体的生理和病理过程。
结合其他技术，化学发光免疫分析可 以用于基因表达分析，检测基因表达 产物的蛋白质水平，从而研究基因功 能和调控机制。
在内分泌疾病的诊断中，化学发光免疫分析可用于检测激素、维生素 D等，有助于评估患者的内分泌功能状态。
在药物研发中的应用
药效学研究
化学发光免疫分析可用于研究药物对生物体的作用机制和效果， 为新药研发提供重要的药效学数据。
药物代谢动力学研究
通过化学发光免疫分析技术，可以研究药物在体内的吸收、分布、 代谢和排泄过程，为新药研发提供药物代谢动力学数据。
04
化学发光免疫分析的优缺 点
优点
高灵敏度
化学发光免疫分析具有较高的灵敏度， 能够检测到极低浓度的目标物质，如肿
瘤标志物、激素等。
稳定性好
化学发光标记物在长时间内保持稳定 ，不易降解，提高了检测的可靠性。
宽线性范围
该方法具有较宽的线性范围，能够检 测到目标物质在较大浓度范围内的变 化。
自动化程度高
特点
高灵敏度、高特异性、低背景干扰、 操作简便、可实现自动化检测等。
历史与发展
1 2 3
起源
20世纪70年代，随着酶标记技术的发展，研究 者开始探索利用化学发光反应进行免疫分析。
发展历程
经过几十年的研究和发展，化学发光免疫分析技 术不断完善，成为一种成熟且应用广泛的免疫分 析方法。
最新进展
新型的化学发光标记物和检测系统不断涌现，提 高了检测的灵敏度和特异性，拓展了应用范围。
在生物医学研究中的应用
生物标志物检测
基因表达分析
化学发光免疫分析可用于检测生物体 中的各种生物标志物，如激素、细胞 因子、生长因子等，有助于研究生物 体的生理和病理过程。
结合其他技术，化学发光免疫分析可 以用于基因表达分析，检测基因表达 产物的蛋白质水平，从而研究基因功 能和调控机制。
免疫检测法PPT课件
质。
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
第十一章固相膜免疫分析技术
• 2、呈色性和光吸收性
• 3、稳定性
对电解质较敏感,电解质可破坏胶体金外周水化 层,而使其聚体沉淀下来。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
9
(二)胶体金得制备
向一定浓度得金溶液中加入一定量得还原 剂使金离子还原成为金原子,形成金颗粒悬液。 常用得还原剂有:枸橼酸钠、白磷、乙醇、过 氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、鞣酸等。
二、胶体金免疫技术得方法种类和 原理
(一)斑点金免疫渗滤试验(DIGFA) 原理:就是以硝酸纤维素膜为载 体并包被了抗 原或抗体得渗滤装置中,依次滴加标本、免疫 金及洗涤液,因微孔滤膜帖置于吸水材料上故 溶液流经渗滤装置时与膜上得抗原或抗体快 速结合并起到浓缩作用,达到快速检测目得。 阳性反应在膜上呈现红色斑点。
以枸橼酸钠为例说明制备方法:
1、制备一定浓度得HAuCl4水溶液,加热至沸。 2、搅动下准确加入一定量得枸橼酸三钠水溶液。
3、继续加热煮沸一定时间。观察溶液变化:淡黄
色 灰色 黑色
红色。
4、冷却至室温后加蒸馏水恢复至原体积。
胶体金得鉴定
主要鉴定指标有:颗粒大小、粒径得均一呈 度、有无凝集颗粒。
良好得胶体金应该就是清亮透明得,如混 浊或液体表面有漂浮物,提示制备得胶体金有 较多得凝集颗粒。
第十一章固相膜免疫分析技术
概述
• 固相膜免疫分析技术
以微孔膜作为固相载体,利用液体可以流 过微孔膜也可以通过毛细血管作用在膜上 向前移行得特性,以酶标记或各种有色微粒 子标记抗体或抗原作为标记物,通过抗原抗 体反应进行抗原或抗体检测得快速检验方 法。
固相膜免疫 分析技术
其她膜载体免疫 分析技术
斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹试验
第11章 临床免疫学检验仪器与技术
第十一章 临床免疫学检验仪器与技术
施新明
目录
第一节 免疫荧光分析仪器与技术 第二节 散射比浊分析仪器与技术 第三节 酶免疫分析仪器与技术 第四节 化学发光免疫分析仪器与技术 第五节 自动化免疫分析仪的染色的技术原理是什么？ 2.时间分辨荧光免疫分析仪的基本原理和性能特点是什么？ 3.散射比浊仪器的分类和原理是什么？ 4.比浊法检测抗原过剩的方法有哪些？ 5.酶联免疫分析技术的原理是什么？ 6.化学发光酶免疫分析的技术原理是什么？ 7.吖啶酯化学发光免疫分析技术的原理是什么？ 8.电化学发光免疫分析技术的原理和特点是什么？ 9.光激化学发光免疫分析技术的原理是什么？
软件系统等。
1.条形码扫描器 2.样品轨架 3.样品针清洗站 4.清洗站 5.清洗机头 6.载片 托盘 7.试剂架 8.用于初始稀释的稀释板 9.用于系列稀释的稀释板
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
1.免疫荧光染色自动操作仪 加样系统由样品针和清洗站、样品轨架和试剂架等构成； 清洗系统包括储液桶、清洗站、清洗机头、废液排除管路
不足，存在抗原过量，需将待测样品进一步稀释复测。 3. 全程动力学空白对照，排除非特异性的干扰，确保检测结果
的可靠性。
五、散射比浊分析仪的性能要求
1.灵敏度 2.精密度 3.准确度 4.携带污染 5.温度准确度与波动度 6.样品和试剂加样准确度与重复性
第三节 酶免疫分析仪器与技术
一、酶联免疫吸附试验
三、全自动酶免疫分析系统
（一）全自动酶免疫分析系统的基本结构
全自动酶免疫分析系统是具有自动加样本、加试剂，自动控 温温育，自动洗板和自动判读计算等功能的分析系统。
可用于各种酶免疫实验、血库筛查、生化检测、细胞培养、 分子生物学等各个方面。
施新明
目录
第一节 免疫荧光分析仪器与技术 第二节 散射比浊分析仪器与技术 第三节 酶免疫分析仪器与技术 第四节 化学发光免疫分析仪器与技术 第五节 自动化免疫分析仪的染色的技术原理是什么？ 2.时间分辨荧光免疫分析仪的基本原理和性能特点是什么？ 3.散射比浊仪器的分类和原理是什么？ 4.比浊法检测抗原过剩的方法有哪些？ 5.酶联免疫分析技术的原理是什么？ 6.化学发光酶免疫分析的技术原理是什么？ 7.吖啶酯化学发光免疫分析技术的原理是什么？ 8.电化学发光免疫分析技术的原理和特点是什么？ 9.光激化学发光免疫分析技术的原理是什么？
软件系统等。
1.条形码扫描器 2.样品轨架 3.样品针清洗站 4.清洗站 5.清洗机头 6.载片 托盘 7.试剂架 8.用于初始稀释的稀释板 9.用于系列稀释的稀释板
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
1.免疫荧光染色自动操作仪 加样系统由样品针和清洗站、样品轨架和试剂架等构成； 清洗系统包括储液桶、清洗站、清洗机头、废液排除管路
不足，存在抗原过量，需将待测样品进一步稀释复测。 3. 全程动力学空白对照，排除非特异性的干扰，确保检测结果
的可靠性。
五、散射比浊分析仪的性能要求
1.灵敏度 2.精密度 3.准确度 4.携带污染 5.温度准确度与波动度 6.样品和试剂加样准确度与重复性
第三节 酶免疫分析仪器与技术
一、酶联免疫吸附试验
三、全自动酶免疫分析系统
（一）全自动酶免疫分析系统的基本结构
全自动酶免疫分析系统是具有自动加样本、加试剂，自动控 温温育，自动洗板和自动判读计算等功能的分析系统。
可用于各种酶免疫实验、血库筛查、生化检测、细胞培养、 分子生物学等各个方面。
7.免疫分析1
19
20
免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
16
五种免疫球蛋白的比较
17
抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
32
8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
33
二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
12
(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
20
免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
16
五种免疫球蛋白的比较
17
抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
32
8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
33
二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
12
(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
免疫分析法
分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原 特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验 的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未 标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要 用于测定小分子抗原。
夹心ELISA
第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断 后加入标准品或者标本
（二）功能检测
利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的 活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应， 肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样 的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些 扰因素的影响。
免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体 （抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体 最常用的方法。
2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的 抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原 特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验 的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未 标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要 用于测定小分子抗原。
夹心ELISA
第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断 后加入标准品或者标本
（二）功能检测
利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的 活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应， 肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样 的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些 扰因素的影响。
免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体 （抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体 最常用的方法。
2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的 抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
临床免疫学检验课件第11章固相膜免疫分析技术ppt
收峰波长增长， A680/A519比值增大。 肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变化粗
略预估胶体金直径大小
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性
胶体金颗粒 （nm）
?斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold
filtration assay, DIGFA) ?斑点金免疫层析试验（dot immunogold
胶体金免 疫技术
chromatography assay, DICA)
?斑点酶免疫吸附试验(dot enzyme linked immunospot assay
（2）保存 ： ? 洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保 存3个月，4℃保存半年 ? 避免冻存：导致胶体金聚集。 ? 20天内标记：胶体金的不稳定性
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
（三）免疫金的制备(P53)
,Dot-ELISA)
?免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第一节 胶体金免疫技术
colloidal gold immunoassay 1.原理：
胶体金特性 ? 胶体特性 ? 呈色性和光吸收性 ? 稳定性 ? 聚沉现象
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
略预估胶体金直径大小
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性
胶体金颗粒 （nm）
?斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold
filtration assay, DIGFA) ?斑点金免疫层析试验（dot immunogold
胶体金免 疫技术
chromatography assay, DICA)
?斑点酶免疫吸附试验(dot enzyme linked immunospot assay
（2）保存 ： ? 洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保 存3个月，4℃保存半年 ? 避免冻存：导致胶体金聚集。 ? 20天内标记：胶体金的不稳定性
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
（三）免疫金的制备(P53)
,Dot-ELISA)
?免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第一节 胶体金免疫技术
colloidal gold immunoassay 1.原理：
胶体金特性 ? 胶体特性 ? 呈色性和光吸收性 ? 稳定性 ? 聚沉现象
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
电化学发光免疫分析法 ppt课件
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光
电化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析
chemiluminescence immunoassay（ CLIA）
CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一 种新的免疫分析技术。
这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的 高度特异性。
化学发光分析优点
化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免 了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度， 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害， 是一种非常优秀的定量分析方法。
化学发光分析缺点
虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但 化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。
3 2+
三联吡啶钌（ [Ru(bpy)3]2+ ）特 点 ] 衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍 [Ru(bpy)
3 2+
不会影响抗体的可溶性和免疫活性；
[Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸 也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测 菜单的开发前景提供了广阔空间。
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按分离方法不同分
微粒子化学发光免疫测定 磁颗粒化学发光免疫测定
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按发光剂不同分为
发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ） 化学发光免疫测定技术 （chemiluminescence immunoassay， CLIA ）
电致化学发光（ECL)
免疫学课件-第十一章中和试验PPT课件
些难以治愈的病毒感染具有重要意义。
03
挑战与前景
目前中和抗体药物的研究与开发仍面临诸多挑战，如抗体筛选、稳定性、
生产成本等问题，但随着技术的不断进步，相信中和抗体药物将具有广
阔的应用前景。
疫苗的研究与开发
研究内容
中和试验在疫苗的研究与开发中也具有重要作用，通过检测疫苗免 疫后机体产生的中和抗体，评估疫苗的保护效果和免疫原性。
中和试验在免疫学研究中的前景
01
02
03
病毒变异研究
中和试验对于研究病毒变 异和进化具有重要意义， 有助于了解病毒变异对免 疫应答的影响。
疫苗研发
中和试验在疫苗研发中发 挥着重要作用，可用于评 估疫苗免疫效果和保护力。
抗体药物研发
中和试验在抗体药物研发 中具有关键作用，可用于 评估抗体药物的疗效和安 全性。
试验方法
将效应分子与细胞结合，观察细胞功能变化，如降低或消除即认为 被中和。
应用
细胞的中和试验可用于细胞信号转导研究、药物作用机制研究等。
03
中和试验的应用
病毒性疾病的诊断
诊断方法
中和试验常用于病毒性疾病的诊断，通过检测患者血清中 的中和抗体，判断是否感染病毒。
诊断价值
中和抗体出现较晚，病毒中和抗体滴度与病毒血症、临床 症状的消失及产生免疫力相一致，故中和试验可用来确定 病毒感染的类型、病程及预后。
免疫学课件-第十一章中 和试验
• 中和试验概述 • 中和试验的常用方法 • 中和试验的应用 • 中和试验的挑战与展望
01
中和试验概述
中和试验的定义
中和试验是一种检测抗体或抗原的试 验方法，通过加入适量的抗体或抗原 ，使原有的免疫反应被抑制或消除， 从而确定抗体或抗原的量。
临床免疫学检验-第十一章固相膜免疫测定
DOT-ELISA优点
• 吸附蛋白能力强，微量抗原吸附完全， 灵敏度高
• 试剂用量少 • 不需特殊设备 • 结果可长期保存。
DOT-ELISA局限性
• 仅为能定性实验 • 非特异性吸附 • BUBBLE FORMATION导致试剂不均结
果模糊
免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
第一节 免疫金标记技术
• 金标记免疫分析技术是一种以抗原抗体 特异性反应为基础,以金颗粒示踪的新 的标记免疫技术.
胶体金及其制备
• 胶体金也称金溶胶,是由金盐被还原成原 金后形成的金颗粒悬液.也称金溶胶。
枸橼酸三钠还原法制备金溶胶
• 加热0.01%氯金酸水溶液适量至沸腾，搅 动下加入1%枸橼酸三钠水溶液适量，金 黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红 色，继续煮沸15分钟，冷却后加蒸馏水 至原体积即可。金溶胶的呈色与溶胶颗 粒的大小密切相关，而金溶胶颗粒的直 径与制备时加入的枸橼酸三钠量密切相 关，改变枸橼酸三钠量可制得不同粒径 和颜色的金溶胶。
临床免疫学检验 第十一章
固相膜免疫分析技术
技术原理
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微 孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒 子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝 酸纤维素（NC）膜。
技术分类
免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式
斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫印迹法 (Western blot)
: probed with Ab & then radiolabeled or enzyme-linked 2nd Ab.
FIGURE 6-12
: a position is visualized by means of an ELISA reaction.
免疫分析法
（1）半抗原和载体结合的化学反应
多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基 形成肽键；与蛋白质或多肽的游离羧基缩合 形成肽键。 甾体：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体 蛋白相连。 抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下可以与 蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合； 氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实 现药物和载体蛋白的连接。
免疫原的制备
免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有 免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐 剂。 水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的 免疫原。 弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以 及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达 到油包水的程度。 不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。
动物免疫
通常的免疫动物为家兔和羊。 免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大 腿肌肉、皮下多点、静脉。 免疫抗原量通常为1~10mg或50~100mg。
试血及效价测定
家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量 0.5ml。 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按 1:1混合，37℃保温2h后观测血细胞的凝聚情 况，即可测得免疫血清的效价。
免疫分析法
一、抗原
1、药物分子的抗原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物 也是完全抗原。 2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性 可能会发生改变。
一、抗原ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清， 通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。 常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白 蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋 白（KLH）等。
（2）半抗原和载体的选择原则
半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗 体反应的微环境；合理利用分子类似物之间 的交叉反应。 载体：载体对监测系统的影响；载体效应在 免疫过程中的影响。
免疫分析法
并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。
Ⅴ
应用与展望
Ⅰ
酶免疫技术
酶免疫技术（EIA）是目前临床应用最多的一种
Ⅱ
免疫分析技术。主要原理是用酶标记的抗体（或 抗原）用于免疫学反应，并以相应底物被酶分解
的显色反应对样品中的抗原（或抗体）进行定位
Ⅲ
分析和鉴定；亦可根据酶催化底物显色的深浅， 测定样品中待测抗原或抗体的含量。
免疫分析法
主讲人：xx
概
前言
要
免疫分析法简介 Section header Section header Section header 免疫分析法 应用与展望
致谢
前言
前言
免疫学是研究免疫系统的结构与功 Ⅱ Ⅲ
能，了解其再免疫应答反应中对机体有
益的防卫功能和有害的病理损伤的机制， 研究有效的免疫措施，实现以防病，治 病为目的的一门现代医学学科。自六十
Ⅳ
含量。
Ⅴ
免疫分析检测
Ⅰ
免疫学检测历史演进
放射免疫检测（兴起于20世纪70 年代) Ⅱ 酶联免疫检测（兴起于20世纪80 年代，各临床机构普遍使用）；
分析 检测
Ⅳ
以化学发光为代表的光生物学标记及免 疫检测技术（20世纪90年代开始推广使 用，产品步入成长期）三个阶段。
Ⅴ
免疫分析检测
Ⅰ 技术的分类 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术 匀相免疫测定 非匀相免疫测定
Ⅰ
4、藻红蛋白（R-RE) 最大吸收波长为565nm,最大发射波长为 578nm,可
Ⅱ
与FITC一起共用488nm激发光，常用于双色免疫荧光染
色。
分析 检测
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
✓ 双抗体夹心法 ✓ 间接法 ✓ 竞争法
3
双抗体夹心法（三明治法）原理
待测物
标记抗体
固相支持物表面
包被抗体
4
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
Hook效应
线性范围
待测物浓度（X）
5
竞争法的原理
待测物 标记抗原
固相支持物表面
包被抗体
6
竞争法的剂量--反应关围
全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育 、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。
11
二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及 基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等
反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁 吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反 应液呈粉红色。
32
磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰 酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应 与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测 定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然 后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫 复合物，洗涤，加酶底物显色。
27
优势
自动化程度高：
前后处理一体化设计，减少人与样品的
接触机会，降低感染。各种自动安全检
测能。
稳 定：
只要避免人为操作错误，
可连续数年良好工作。
准 确：
不存在交叉感染。反应振荡，
确保检测 准确。
28
高 速：
加注、读板速度快
扩 展 性：
软件可升级，样本量增加，可联机使用
用户做主更多：
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档
29
4、管式固相酶免疫测定仪
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配 套试剂
用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗 原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物
ABTS 测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点
22
检 测 光 纤
23
反应板 反应板 夹具
24
清 洗 装 置
25
供水箱 废水箱
26
检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例
仪器操作各单元如下（满板）
加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器） 加酶时间： 4分46秒(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5分30秒 加终止液： 2分42秒 读板时间： 2分58秒
36
辣根过氧化物酶的色原底物
HRP最常用的色原底物有:
邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸6)[ABTS](杂环吖嗪)
四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对
37
OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的 作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’-二氨基偶 氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至 492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强 酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致 突变作用。
定标
测定的精密度CV在3%左右
30
5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗 粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在 微粒上。
第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃 纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体 则通过膜滤出。
以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定31 。
12
1、微孔板固相酶免疫测定仪器
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于：
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
13
14
15
2、半自动微孔板式ELISA分析仪
在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪
ELISA）2
需要了解的基本概念
▪ 酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA)
✓ 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物 测定
✓ 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离 才能测定. 分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相 酶免疫测定ELISA 。
▪ ELISA的测定模式 :
待测物浓度（ X ）
7
标记抗体 （二抗）
待测抗 体
间接法原理
包被体
包被抗 原
8
标记抗原
俘获法原理
包被体
待测抗体 俘获抗体 （二抗）
9
标记抗原 待测抗体
双抗原夹心法原理
包被体
包被抗原
10
我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为 酶标仪。
一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能， 还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐 。
33
三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
（一）评价指标和方法
1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价
34
重点是光学部分 1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测
35
四、酶免疫分析仪的临床应用 １．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品
测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。
16
3、全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统
温育系统
洗板系统
判读系统
机械臂系统
液路动力系统
软件控制系统等组成
17
18
温育箱 反应板 迭式存储器
19
X-Y头架
20
样品架 50根 装 50×3
21
4根独立 上下吸 移管
第十一章 免疫分析技术和相关仪器
1
第一节 酶免疫分析仪
一、酶免疫分析技术的分类：
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:
酶扩大免疫测定
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
非均相酶免疫测定
固相酶免疫法
(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和 试剂组成：
试剂包括：
抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体
特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm）
FITC结合的特异抗体或抗原
碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原
什么样的反应
底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯
3
双抗体夹心法（三明治法）原理
待测物
标记抗体
固相支持物表面
包被抗体
4
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
Hook效应
线性范围
待测物浓度（X）
5
竞争法的原理
待测物 标记抗原
固相支持物表面
包被抗体
6
竞争法的剂量--反应关围
全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育 、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。
11
二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及 基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等
反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁 吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反 应液呈粉红色。
32
磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰 酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应 与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测 定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然 后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫 复合物，洗涤，加酶底物显色。
27
优势
自动化程度高：
前后处理一体化设计，减少人与样品的
接触机会，降低感染。各种自动安全检
测能。
稳 定：
只要避免人为操作错误，
可连续数年良好工作。
准 确：
不存在交叉感染。反应振荡，
确保检测 准确。
28
高 速：
加注、读板速度快
扩 展 性：
软件可升级，样本量增加，可联机使用
用户做主更多：
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档
29
4、管式固相酶免疫测定仪
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配 套试剂
用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗 原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物
ABTS 测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点
22
检 测 光 纤
23
反应板 反应板 夹具
24
清 洗 装 置
25
供水箱 废水箱
26
检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例
仪器操作各单元如下（满板）
加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器） 加酶时间： 4分46秒(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5分30秒 加终止液： 2分42秒 读板时间： 2分58秒
36
辣根过氧化物酶的色原底物
HRP最常用的色原底物有:
邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸6)[ABTS](杂环吖嗪)
四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对
37
OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的 作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’-二氨基偶 氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至 492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强 酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致 突变作用。
定标
测定的精密度CV在3%左右
30
5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗 粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在 微粒上。
第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃 纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体 则通过膜滤出。
以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定31 。
12
1、微孔板固相酶免疫测定仪器
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于：
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
13
14
15
2、半自动微孔板式ELISA分析仪
在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪
ELISA）2
需要了解的基本概念
▪ 酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA)
✓ 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物 测定
✓ 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离 才能测定. 分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相 酶免疫测定ELISA 。
▪ ELISA的测定模式 :
待测物浓度（ X ）
7
标记抗体 （二抗）
待测抗 体
间接法原理
包被体
包被抗 原
8
标记抗原
俘获法原理
包被体
待测抗体 俘获抗体 （二抗）
9
标记抗原 待测抗体
双抗原夹心法原理
包被体
包被抗原
10
我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为 酶标仪。
一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能， 还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐 。
33
三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
（一）评价指标和方法
1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价
34
重点是光学部分 1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测
35
四、酶免疫分析仪的临床应用 １．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品
测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。
16
3、全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统
温育系统
洗板系统
判读系统
机械臂系统
液路动力系统
软件控制系统等组成
17
18
温育箱 反应板 迭式存储器
19
X-Y头架
20
样品架 50根 装 50×3
21
4根独立 上下吸 移管
第十一章 免疫分析技术和相关仪器
1
第一节 酶免疫分析仪
一、酶免疫分析技术的分类：
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:
酶扩大免疫测定
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
非均相酶免疫测定
固相酶免疫法
(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和 试剂组成：
试剂包括：
抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体
特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm）
FITC结合的特异抗体或抗原
碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原
什么样的反应
底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯