第11章免疫分析 ppt课件

反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁 吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反 应液呈粉红色。
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磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰 酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应 与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测 定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然 后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫 复合物，洗涤，加酶底物显色。
第十一章 免疫分析技术和相关仪器
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第一节 酶免疫分析仪
一、酶免疫分析技术的分类：
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:
酶扩大免疫测定
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
非均相酶免疫测定
固相酶免疫法
(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，
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1、微孔板固相酶免疫测定仪器
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于：
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
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2、半自动微孔板式ELISA分析仪
在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪
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三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
（一）评价指标和方法
1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价
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重点是光学部分 1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测
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四、酶免疫分析仪的临床应用 １．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品
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检 测 光 纤
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反应板 反应板 夹具
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清 洗 装 置
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供水箱 废水箱
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检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例
仪器操作各单元如下（满板）
加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器） 加酶时间： 4分46秒(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5分30秒 加终止液： 2分42秒 读板时间： 2分58秒
定标
测定的精密度CV在3%左右
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5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗 粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在 微粒上。
第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃 纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体 则通过膜滤出。
以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定31 。
待测物浓度（ X ）
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标记抗体 （二抗）
待测抗 体
间接法原理
包被体
包被抗 原
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标记抗原
俘获法原理
包被体
待测抗体 俘获抗体 （二抗）
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标记抗原 待测抗体
双抗原夹心法原理
包被体
包被抗原
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我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为 酶标仪。
一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能， 还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐 。
✓ 双抗体夹心法 ✓ 间接法 ✓ 竞争法
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双抗体夹心法（三明治法）原理
待测物
标记抗体
固相支持物表面
包被抗体
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夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
Hook效应
线性范围
待测物浓度（X）
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竞争法的原理
待测物 标记抗原
固相支持物表面
包被抗体
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竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度（ Y ）
线性范围
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档
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4、管式固相酶免疫测定仪
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配 套试剂
用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗 原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物
ABTS 测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点
ELISA）2
需要了解的基本概念
▪ 酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA)
✓ 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物 测定
✓ 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离 才能测定. 分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相 酶免疫测定ELISA 。
▪ ELISA的测定模式 :
全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育 、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。
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二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及 基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等
测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。
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3、全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统
温育系统
洗板系统
判读系统
机械臂系统
液路动力系统
软件控制系统等组成
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温育箱 反应板 迭式存储器
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X-Y头架
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样品架 50根 装 50×3
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4根独立 上下吸 移管
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辣根过氧化物酶的色原底物
HRP最常用的色原底物有:
邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸6)[ABTS](杂环吖嗪)
四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对
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OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的 作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’-二氨基偶 氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至 492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强 酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致 突变作用。
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和 试剂组成：
试剂包括：
抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体
特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm）
FITC结合的特异抗体或抗原
碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原
什么样的反应
底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯
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优势
自动化程度高：
前后处理一体化设计，减少人与样品的
接触机会，降低感染。各种自动安全检
测能。
稳 定：
只要避免人为操作错误，
可连续数年良好工作。
准 确：
不存在交叉感染。反应振荡，
确保检测 准确。
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Байду номын сангаас
高 速：
加注、读板速度快
扩 展 性：
软件可升级，样本量增加，可联机使用
用户做主更多：