第九章 园艺植物遗传转化载体的构建
《园艺植物育种学》复习大纲
阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。
——培根《园艺植物育种学》复习大纲绪论一、内容提要：选育园艺植物新品种是发展园艺生产的关键途径之一。
各种各样的栽培园艺植物种类及其品种类型都是从野生植物进化而来。
利用园艺植物的自然变异和人工创造变异并进行人工选择的进化就是优良性、适应性、稳定性和整齐性，品种具有特异性等特性。
良种是在适应的地区，采用优良的栽培技术，能够生产出高产、优质，并能适时供应产品的品种。
它有提高单位面积产量、改进产品品质、提高抗病虫害能力以减少农药污染、增强适应性和抗逆性以节约能源、延长产品的供应和利用时期，适应集约化管理、节约劳力等多方面的作用。
园艺植物育种学是研究选育与繁殖园艺植物优良品种的原理和方法的科学，是以遗传学、进化论为主要基础涉及多门学科的综合性应用科学。
它研究的任务是根据遗传变异的规律，合理选择利用种质资源，通过发现和创造变异来选择优良品种，以及提高种性、防止混杂退化、加速良种繁殖的原理和方法。
园艺植物育种有着悠久的历史。
19世纪才有专门的育种机构，20世纪育种理论、方法进步很快，新品种选育成果巨大。
二、思考题：1、了解品种的概念及其属性；2、良种在园艺植物生产中的作用？3、自然进化与人工进化的区别？4、园艺植物育种学的任务和内容？第一章育种对象与目标一、内容提要园艺植物多为周期长的多年生植物，育种年限长，育种目标涉及产量、品质、熟期及抗性等一系列目标性状。
因此，因地制宜选择育种对象，明确育种目标，制订育种方案，是育种工作成败的关键。
二、思考题：1、当前园艺植物育种的总目标是什么？2、园艺产品的品质按产品用途和利用方式大致可分为哪几种？3、制订育种目标的主要根据和原则是什么？第二章园艺植物的繁殖习性、品种类别和育种方法园艺植物繁殖方式不同，其遗传特征就不一样，因而相应采取的育种程序和方法也不同。
此外，栽培植物品种根据其群体遗传组成，可分为自交系品种、群体品种、杂交种品种和无性系品种。
第九章 园艺植物遗传转化载体的构建
• Ubiquitin启动子
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 二、Ti中间表达载体的构建 • (二)嵌合基因的构建
• 嵌合基因: 来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在
一起而构成的基因.
• 完整的嵌合基因: 完整,正确的可读框,能正确表达,3′端的终止信 号. “植物特异性启动子+目的基因+终止子”、 “植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和 “植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。
一个理想的载体应该具备以下几个 特点：
• 有一个或多个复制起点，可在一种生物体 中自主复制 • 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 • 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA 分子是否进入宿主细胞 • 具有较小的分子质量和较高的拷贝数 • 无毒性
基因工程中所用载体的分类 • 按来源分类
• 细菌质粒 • 噬菌体类 • 酵母质粒 • 病毒DNA衍生物
Ti质粒介导基因转化的原理
• 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮等)。
• 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因 (vir)表达:当根癌农杆菌接触 到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经 VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。
（2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌 产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共 24个基因。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
植物载体构建流程
植物载体构建流程植物载体构建是个还挺有趣的事儿呢，咱就像搭积木一样把各种元素组合起来，让植物能按照我们想要的方式生长或者表达特定的基因。
一、载体选择。
我们得先挑个合适的载体，就像给植物找个合适的房子一样。
这载体有很多种哦，像质粒载体就比较常用。
它就像一个小小的工具箱，里面有各种工具（不同的功能元件）。
我们要根据自己的目的来选，要是想把某个基因送到植物细胞里去，就得选那种能在植物细胞里好好工作的质粒载体。
比如说，有的质粒是专门为双子叶植物设计的，有的呢又更适合单子叶植物。
这就好比不同的房子适合不同的住户，可不能选错啦。
二、目的基因获取。
接下来就是找我们想要的那个“小秘密”——目的基因。
这目的基因可以从很多地方来，有时候是从其他植物里发现的一个特别厉害的基因，能让植物抗虫或者抗旱啥的。
我们就像寻宝一样把这个基因找出来。
找的方法也有不少哦，可以用基因文库筛选，就像是在一个装满各种基因宝贝的大仓库里找我们要的那个小宝贝。
还有一种是通过PCR（聚合酶链式反应）来扩增这个基因，这就像是用复印机把这个基因复印很多份一样，让我们有足够的量可以用。
三、基因连接。
把目的基因找到后，就要把它和我们选好的载体连接起来啦。
这就像是给小宝贝找个合适的座位，让它能稳稳地待在载体这个小房子里。
我们会用到一些酶，比如说限制性内切酶，这个酶可神奇了，它就像一把小剪刀，能在载体和目的基因的特定位置剪开，然后再用DNA连接酶把它们像缝衣服一样缝起来。
这过程得小心翼翼的，要是连接错了地方，那可就麻烦啦，就像把东西放错了口袋一样。
四、转化。
连接好之后呢，就要把这个带着目的基因的载体送到植物细胞里去啦。
这就像是给植物送个小礼物。
转化的方法有很多种哦。
最常见的一种是农杆菌介导转化法。
农杆菌就像是一个小邮差，它天生就有把自己身上带着的一些东西送到植物细胞里的能力。
我们就把构建好的载体放到农杆菌里，然后让农杆菌去感染植物细胞，这样载体就跟着进去了。
番茄载体构建及遗传转化
10.
Key words:MicroRNA, mir156, mir169, development, abiotic stress, tomato
1前言
1.1课题的提出
生物体内小分子RNA自上世纪80年代末被科学家们发现以来，人们相继在许多真核模式生物中找到一系列有功能的非编码小分子RNA，这些小分子RNA的发现极大地拓展了人们对分子生物学的认识和了解，同时也为人们的研究提供了一个新的方法和途径。近些年来，人们还相继在生物体内发现了lsiRNA (long short interference RNA)、piRNA (PIWI-interacting RNA)、NAT-siRNA (natural antisense-transcript siRNA)和tasiRNA (trans-acting siRNA)等众多具有不同调节功能的小分子RNA，在调节不同生物的环境应答和生长发育等过程中发挥着不可忽视的关键作用。MicroRNAs (miRNAs)是一类在进化上高度保守的内源非编码小分子RNA，长度大约为21个核苷酸(Ambros, 2001)。它们通过与目标靶基因互补配对使转录受到抑制或靶基因降解等的方式在转录后的调节方面起着重要的作用(Bartel, 2004)。
园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化
13
第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
园艺植物遗传转化
5
第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
园艺植物遗传转化
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
园艺植物遗传转化
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
园艺植物遗传转化
14
第二节 转化的受体系统
第九章 植物遗传转化载体
第九章 植物遗传转化载体
一、植物遗传转化载体的种类和特点 二、农杆菌质粒载体系统的结构、功能和构建 三、植物病毒载体 四、叶绿体转化载体 五、常用的选择标记和无选择标记基因转化系统
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第一节、植物遗传转化载体的种类和特点
作为遗传转化载体必须具备的特点：
1、能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去（核基因组或细胞内） 2、它能提供被寄主细胞的复制和转录系统识别的DNA序列，以保证导入外源 基因能够在受体植物细胞内正常的复制和表达。
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植物遗传转化载体的种类
1、质粒载体：Ti质粒载体---共整合载体系统 ---双元载体系统（构建方式不同） Ri质粒载体 2、病毒载体系统：单链RNA病毒载体系统 单链DNA病毒载体系统 双链DNA病毒载体系统
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植物遗传转化体系的建立
利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。 改造的目的有以下几点：
（1）去除T-DNA区的激素基因。因为激素基因的产物会导致转化 细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再 生。 （ 2 ）保留 T-DNA 区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的 正常转化。
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
除 Ti 质 粒 外 ， 发 根 农 杆 菌 (Agrobacterium
rhizogenes) 的Ri质粒 (Root-inducing plasmid) 也
已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入 Ri质粒中的 T-DNA，经一段 时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。发状根没有向地性， 可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速 度一个月可增殖数倍到数百倍。发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖 于其菌体中的Ri质粒。例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向 分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.4 胚状体 胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法也同愈 伤组织。 用根癌农杆菌 LBA4404 介导番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ PRSV-CP ）与 核酸酶（Nuclease）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶 型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。NPT II分析 和Southern blot分子杂交结果表明，PRSV- CP- Nuclease嵌合基因 已经整合到番木瓜核基因组中（周鹏等，1995）。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
35
病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
10
Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
22
启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
植物遗传转化的载体系统
2．植物遗传转化的载体系统。
作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。
目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。
（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。
其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。
Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。
Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。
Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。
T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。
植物基因工程载体和其构建培训课件
建
植物基因工程载体和其构
32
建
TOPO技术
拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重 新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。
TOPO克隆是一种将拓扑异构酶 与 T- 载体相结合的 PCR 产物 快速克隆系统 pCR-TOPO ，无 需 DNA 连接酶做连接。
3'末端的突出 T 上共价结合 了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当 带 3' 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时， 拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口 连接起来。
（1）T载体
PCR产物往往在3’端突出一个或多个A， 将T-载体的MCS中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为T-A克隆。
➢ 克隆载体线性化； ➢ 克隆载体末端补平； ➢ 克隆载体末端加T。
植物基因工程载体和其构
29
建
➢ 商业化T载体 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内
➢ 长度：4361 bp；
➢ 选标记：氨苄青霉素和四环素抗性；
➢ 多克隆位点：24个克隆位点；
其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。
植物基因工程载体和其构
23
建
衍生质粒：pBR325、pBR327及pAT153等。
植物基因工程载体和其构
27
建
（3）pBluescript II KS(±)系列载体
在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和T3。可对插 入片段进行转录。还加入了丝状噬菌体f1的复制起点。
植物基因工程载体和其构
28
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
园艺植物遗传转化
第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
（1）特性：PEG是一种水溶性的细胞融合剂和渗透剂，相对 分子质量为1500—6000，pH4.6—4.8，因聚合程度不同而异。 （2）转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成 分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的 表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性， 诱导原生质体摄取外源基因DNA。
园艺植物遗传转化
第二节 园艺植物遗传转化方法
3、优缺点 基因枪转化法具有下列优点： 1）无宿主限制，特别适宜那些由原生质体再生植株较为困难和 对农杆菌感染不敏感的单子叶植物，提高了单子叶植物的转化 效率； 2）操作简单，可控程度高，可以根据实验的需要调控微弹的速 度和摄入浓度，命中特定层次的细胞，提高遗传转化效率； 3）靶受体类型广泛不受基因型的限制，能转化所有具有分省潜 力的植物的任何组织或细胞，包括原生质体、根、叶以及种子 的胚、子叶、分生组织、愈伤组织、花粉、子房等；
Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat
基因导入玉米原生质体。 电穿孔转化法可用于原生质体的瞬时和稳定
转化，也可用于带壁的植物细胞的遗传转化。
园艺植物遗传转化
第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上 造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4mm左右， 每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入；
园艺植物遗传转化
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(3)稳定的外植体来源
遗传转化的频率低，需要反复的实验，所以要建立一 个高产的组织培养再生系统并能用于遗传转化，需要大量 的、稳定的外植体作为材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼 叶等，或采用可进行快速繁殖的材料
笫九章 植物转化载7PPT课件
笫二节 根癌农杆菌TI质粒
• TI质粒是根癌农杆菌染 色体外的遗传物质,为双 股共价闭合的环状DNA 分子,约有150 200KB. • 章鱼碱型 • 胭脂碱型 • 农杆碱型 • 农杆菌素碱型(琥珀碱型)
• 在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中, 都含有控制肿瘤诱发的两种基因区段: ★T区段~在肿癌形成期间,从根瘤土壤杆 菌 的TI质粒上导入植物细胞的DNQ片 段,约为23KB. ★和毒性区段~在细菌中表达的数个致瘤基 因,与T区段从细菌转移到植物细胞的遗 传有关.
笫九章 植物转化载体的构建
这一章主要有七节:
一植物基因工程载体的种 类和特征 二 根癌农杆TI质粒 三 T-DNA的结构特点和功 能 四 T-DNA转移的机制 五 植物基因转化载体系统 六 发根家杆菌的RI质粒 七 无选择标记基因植物转
物 植 因 基 转
笫一节 植物基因工程载体的种 类和特征
• 生物载体介导的遗传转化 • 非载体介导的遗传转化种 质转化系统 • 直接转化系统 • 生物载体介导的遗传化根据截体的不同 可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗 传转化.
• VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为 16.2,47.4,21.3,和75.8KDA的四种不同的蛋白分子. • VIRD1编码一个DNA松弛酶,这种酶与DNA拓扑异构 酶I作用类似,它先在DNA链上切割一个缺刻,使DNA 解旋后再封闭,降低了DNA超螺旋数目. • VIRB:有两种信号肽序列:一种与细菌输出信号肽序列 相似.另一种信号序列属于脂蛋白信号序列. • VIRC:是毒性区各位点惟一以反针方向转录的位点,含 有两个开放阅读框架VIRC1和VIRC2,分别编码1个约 25KDA的蛋白质和个约22KDA的蛋白质. • VIRH:对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒 作用.
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Ti质粒介导基因转化的原理
• 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮等)。
• 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因 (vir)表达:当根癌农杆菌接触 到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经 VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。
的筛选；
⑶ 插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆和操作；
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
⑷ 引入植物基因的启动子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在 植物细胞内能正确高效地转录表达； ⑸ 除去Ti质粒上的其他非必需序列，以最大限度地缩短载体的长 度。 研究表明,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性, 因此,可以先将T-DNA的片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外 源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的Ti质粒上. 中间载体: 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体; 受体Ti质粒: 接受中间载体的Ti质粒.
• 3. T-DNA单链分子释放： virD 基因编码一种核酸内切酶，先在 T-DNA 右边缘区 (RB) 切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区 (LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。 • 4. T-DNA 单链分子转移到寄主细胞： T-DNA 单链分子与 vir 产物 VIR D2蛋白共价结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助引导下穿 过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细 胞膜和核膜。
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
(三)御甲载体
定义: 无毒的(non-oncogenic)Ti质粒载体,又称onc-载体。 野生型Ti质粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作为 基因转化的载体，必须切除T-DNA中的onc基因，即解除其武
装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失的T-DNA
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(二)天然Ti质粒存在的缺点
1.缺点 ⑴ 野生型Ti质粒分子十分巨大； 野生型Ti质粒分子一般都为180-240 kb,几乎无法进行基因工 程的操作，所以应去除一切不必要的大片段DNA。 ⑵ 限制性内切核酸酶位点众多； Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用 的单一限制性内切核酸酶位，因此很难通过体外DNA重组技术 直接向野生型Ti质粒导入外源基因. ⑶ T-DNA区段内含有许多编码基因； 植物生长素合成酶基因,细胞分裂素合成有关酶基因等. ⑷ 在大肠杆菌中不能复制。
• Ti质粒的发现历史
• 1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致 癌质粒（Tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒.
• 最初的发现和命名是1907年,Smith 和Townsent发现双子叶植
物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)诱发形成的.
植物伤口
酚类物质诱导信号
诱导信号
信号受体（VIR A）
信号传递
VIR G
诱导表达
VIR G激活virB、virC、virD、virE 、virH表达
VIR D
LB
RB
T-DNA单链分子释放
VIR D2 、 VIR D4 、VIR B、 VIR E2等
转移到寄主细胞
整合到植物染色体中
土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制
• CaMV35S启动子
• Ubiquitin启动子
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 二、Ti中间表达载体的构建 • (二)嵌合基因的构建
• 嵌合基因: 来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在
一起而构成的基因.
• 完整的嵌合基因: 完整,正确的可读框,能正确表达,3′端的终止信 号. “植物特异性启动子+目的基因+终止子”、 “植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和 “植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
(一) Ti质粒 2.种类
2.2 根据功能区段不同 基因转移T-DNA区 (transferred DNA region)： 与基因转移相关 毒性区,即Vir区 (Virulence region,Vir): 激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区 接合转移区 (region encoding conjuation,Con) 调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移 自我复制区 (origin of replication,Ori) 调控Ti质粒自我复制
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 由AATAAA编码的mRNA序列AAUAAA的作用是发出信号，让核 酸酶在此序列下游10-15bp 处切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在 切割点的3‘端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA的3端结
合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护mRNA的作用.
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 三、Ti共整合转化载体的构建
共整合载体定义
指中间载体与改造后的受体Ti质粒之间,通过同源重组所产生的 一种复合型载体.
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 二、Ti中间表达载体的构建 • (一)启动子及调控序列
经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因的 转录与表达，其先决条件在于必须要有合适的启动子和调控序 列。 真核生物基因调控序列中，大多数都具有“TATA”框，位于距 离转录起始点约30个核苷酸的上游区域，上游DNA的序列成分 如“CAAT”(在上游-80 ～-70bp处)也普遍存在于许多真核生物 基因的启动子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，从而 使基因在转录过程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信号。
Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA
分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。
迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它 们的Ti质粒结构特性均有差别。 根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可 被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、
第九章 园艺植物遗传转化载体 的构建
主要内容
• 根癌农杆菌Ti质粒基因转载体的构建 • 发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构建 • 载体构建中常用的选择标记基因和报告基 的因 • 园艺植物常用的遗传转化载体类型 • 目的基因与载体的连接
载体（vector） ？ 能载带微量物质共同参与某种化学 或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中 将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自 我复制的DNA分子。
根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens）
alfalfa 冠瘿瘤病(根癌病)症状 1、植物根及茎基部产生 2、最初原因是受伤后引起
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化 载体的构建
酚类物质
VIR A
由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
一、Ti质粒的改造
(一)Ti质粒 1.定义
是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状 DNA大分子，其大小为180-240 kb。
2.种类
2.1 根据冠瘿碱的种类不同 章鱼碱型(octopine); 胭脂碱型(nopaline);农杆碱型(agropine) 和农杆菌素碱型(agrocinopine) or琥珀碱型(succinamopine)
基因工程中所用载体的分类
• 在植物基因转化的研究中，主要使 用细菌质粒，按用途可分为：
– 克隆载体 – 表达载体 – 转化载体
按功能及构建过程分类
在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠 杆菌质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以 根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重点
一个理想的载体应该具备以下几个 特点：
• 有一个或多个复制起点，可在一种生物体 中自主复制 • 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 • 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA 分子是否进入宿主细胞 • 具有较小的分子质量和较高的拷贝数 • 无毒性
基因工程中所用载体的分类 • 按来源分类
• 细菌质粒 • 噬菌体类 • 酵母质粒 • 病毒DNA衍生物
（2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌 产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共 24个基因。
（3）Con区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）, 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码 区。 （4）Ori区（origin of replication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。
部位通常被大肠杆菌中的一种常用质粒pBR322取代.这样任何 适于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段,都可通过pBR322质 粒DNA与卸甲载体的同源重组而被共整合到onc- Ti质粒载体上.
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建