第十一章 质谱技术在蛋白质多肽化学

Ar+（高动能的）+ Ar（热运动的）→ Ar（高动能的）+ Ar+（热运动的）
经电荷交换后的低动能(热)的Ar+被偏转 出快原子流，获得高动能快速的Ar原子对样品 分子进行轰击，一般样品调在甘油基质之中， 当快原子束轰击在涂有样品的金属板上，快原 子大量动能以各种方式消散，其中的一些能量 导致样品的挥发和离解。
+
+ ++ - -- + + -+
+
+ + + +
+
+ +
+
准分子离子
+
其他离子
试样离子
ESI-MS
这种分子离子特点是分子离子往往带多个电荷。这 些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成， 所以在正离子或负离子谱上会观察到(M+nH) n+或(MnH) n-的峰。 对于生物大分子，在ESI谱上出来的往往是一组带不 同电荷的分子离子峰，根据仪器上记录下来的每个 峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值。 实际上从一组峰上可算出无数个分子量值，它们相 互之间会略有差别，一般需在计算机上经特定的程 序处理，找出最接近实际的分子量值。
MW range
Mass assignment accuracy
Compatible with on-line LC/CE-MS
ESI
Low tolerance (≤20 mM) for nonvolatile buffers, alkali metal salts, detergents; online LC-MS used for contaminant removal
ESI-MS特点
优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质
与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结 构和共价修饰位点的测定问题，并可用于研 究DNA 与药物、金属离子、蛋白质和抗原 与抗体的相互作用。
缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，
而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分 子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析 比较困难。
MALDI-MS
基质辅助的激光解析电离(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)技术产生的离子 常用飞行时间(time-off-flight,TOF)检测器来检 测，所以MALDI名字常与TOF联在一起，即 叫基质辅助的激光解析飞行时间质谱仪 (MAL DI-TOF-MS)。 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间 质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号， 并依据质量/电荷之比(m/z) 来对该多肽进行分 析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。
质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组 合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源 的离子束中不同质荷比的离子按空间位臵，时间先后或运 动轨道稳定与否等形式进行分离；
检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。
质谱仪组成
进样系统 真空系统
Sample inlet
Ionisation source
ESI-MS
Charged Droplets
+ + + + + - + - Evaporation
Analyte Ions
Solvent Ion Clusters Salts/Ion pairs Neutrals
--+ + ++ ++ + + -+ ++ +
+
+ -+ ++ +
+
Rayleigh Limit Reached
第十一章
质谱技术在蛋白质、 多肽化学中的应用
第一节
第二节 第三节
蛋白质、多肽质谱技术的发展
蛋白质、多肽质谱技术介绍 质谱在蛋白质、多肽分析中的应用
第一节
蛋白质、多肽质谱技术的发展
一、基本原理
质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形 成离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同进 行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方 法。 蛋白质、多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子 转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁 场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质离 子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确 定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。
离子源
离子源是质谱仪的心脏，可以将离子 源看作是比较高级的反应器，其中样品发生 一系列的特征降解反应，分解作用在很短时 间(～1μs)内发生，所以可以快速获得质谱。
离子化的方法
电子轰击电离 化学离子化 场电离，场解吸 Electron Impact Ionization，EI Chemical Ionization，CI Field Ionization FD， Field Desorption FD 快原子轰击 Fast Atom Bombardment，FAB 电喷雾电离 Electrospray Ionization，ESI 基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI
FAB-MS
FAB-MS特点
这种方法要求简单，灵敏较高。FAB产 生的分子离子非常稳定，不易裂解，是准确 测定多肽化合物分子量的有效方法。应用于 一些较复杂的混合物，能测出其各组份的分 子量。当然由于不易获得碎片峰，FAB质谱 在测定多肽顺序时遇到困难。
ESI-MS
电喷雾离子化技术（electrospray ionization ，ESI）利用强静电场从 溶液直接产生气态离子化分子。ES I 可以与液相色谱、高效液相色谱、 毛细管IEF 以及毛细管电泳等多种 进样器联用。流出液在高电场下形 成带电喷雾，在电场力作用下穿过 气帘 。
MALDI-TOF-MS
MALDI-MS特点
对于一些分子量较大(＞1000000Da)或疏水性强的 蛋白质，MALDI比ESI更有效。 MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化 学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选 择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MAL DI进行分析。 MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影 响，且灵敏度也比别的离子化方式高。
软电离
ESI和MALDI这两种“软电离”技术解决了 极性大、热不稳定的蛋白质的离子化和大 分子生物的分子质量的测定问题。而且， 这两种方法在灵敏度、准确度和分析混合 物的复杂性方面都比以前的质谱技术有了 显著的改善，
Ionization method
Tolerance for buffers, salts, and detergents
≤150 kDA
±0.005%-0.01% to 50 kDA
±0.02%-0.03% to 150 kDA
Yes
MALDI
High tolerance (≥50 mM) for alkali metal salts, phosphate, urea, etc.; tolerant of some nonionic detergents; intolerant of SDS
≥350 kDA
±0.01%-0.05% to 25 kDA ±0.05%-0.3% to 300 kDA No
生物质谱两种主要电离方法比较
质量分析器
质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离， 用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器 的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围 （质量范围）和分辨率。 扇形磁分析器 四极杆分析器 离子阱分析器 飞行时间分析器 傅里叶变换分析器
扇形磁分析器
不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产 生不同的偏转，从而使离子束发散。由于不同质 荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半 径，通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口 的离子，从而实现离子的空间分离，形成质谱。
MALDI-TOF-MS
由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故 多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直 接进入飞行时间质量分析仪(TOF massanalyz er)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子 由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的 时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷 的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行 时间越短TOF质量分析器被认为是与MALDI 的最佳搭配。
MALDI-MS
待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化 学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或 载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥 发使样品整合于格状晶体中，样品然后臵于激光离子 发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化 学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于 多肽，使之由固态样品混合物变成气态。
第二节
蛋白质、多肽质谱技术介绍
蛋白质、多肽质谱质谱技术介绍
一．质谱仪组成 二．离子源 三．质量分析器 四．检测器 五．串联质谱及联用技术
质谱仪组成
质谱仪一般由四部分组成： 进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适 当部位； 离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离 子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；
80年代初
Barber等人又引入了快原子轰击(fast atom bombardment，简称FAB)电离技术，并成功地 测定了一个26肽的结构，从而使得质谱技术应 用于蛋白质和肽的结构测定这一设想变为现实。
80年代末
两种更新的技术得到发展，它们分别是 John F enn 发明的电喷雾电离(electrospray ionization，ESI) 和Hillenkamp等人发明的基质辅助的激光解吸电离 (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)。 这两种技术解决了极性大、热不稳定的蛋白质、 多肽分子的离子化和大分子量的测定问题。另外， 这两种质谱无论在灵敏度、准确性和在分析混合物 的复杂性方面都比以前的技术有了显著的改善，从 而大大拓宽了质谱技术在蛋白质领域中的应用，可 以说是质谱技术在生物大分子中应用的一场革命。
ESI-MS
ESI-MS
ESI 一般分为正离子ESI 和负离子ESI 两类。 正离子ESI 的原理：在一个金属喷嘴的针尖上加 有2.5～6 kV高电压，经强电场作用，样品溶液从针尖 小孔喷出，成为一个个带正电的液滴。在迎面吹来的 热氯气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发，液滴变小， 液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面 张力时，液滴便发生崩解，形成更小的液滴。如此形 成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的 溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分 析纪录。 负离子EIS 的过程与此类似，唯电性相反。
蛋白质、多肽质谱发展史
20世纪60年代
科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽的结 构分析中存在的潜力，但由于离子化技术的限制， 近30年来，质谱技术只在有机化合物小分子的结构 测定中得到应用，而对于大分子(分子量超过1000D a)、极性分子和难气化的分子，则显得无能为力。
70年代
Macfarlane等人发明了一种叫等离子体解吸 (Plasma desorption, PD)的离子化技术，使得质 谱测定分子量范围扩大到几千道尔顿。
Ion separation
离子源
加速区
Output
计算机数据 处理系统
质量分析器
检测器
Detector
离子源
离子源的功能是将进样系统引入的气态样品 分子转化成离子。由于离子化所需要的能量 随分子不同差异很大，因此，对于不同的分 子应选择不同的离解方法。 通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电 离方法，而给样品较小能量的电离方法为软 电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电 离的样品。
பைடு நூலகம்子化的方法
根据不同的离子化方法，常用的适用于 蛋白质、多肽研究的质谱技术方法包括FABMS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中 又以MALDI-MS和ESI-MS应用最为广泛，这 两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度， 从而导致了新的软件和检测器的发展。
FAB-MS
直到80年代FAB质谱问世，质谱技术才真正推广到 蛋白质领域。 它是一种用快速原子轰击被分散在高沸点溶剂(如 甘油)中的待测化合物，从而产生分子离子。快原 子的产生是通过电离隋性气体Ar、Xe或He产生的 Ar+、Xe+或He +被电场加速，从而具有较大动能， 以后通过Ar气室进行电荷交换反应：