实验报告一 紫外光

课程名称：生物仪器分析 指导老师 成绩：__________________________ 实验名称：紫外可见分光光度计操作及应用 实验类型：探究

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤（必填）

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析 七、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、掌握紫外-可见分光光度计的原理、基本结构与特点，学会仪器的使用方法。

2、掌握制作吸收曲线和标准曲线，能正确选择合适的测定波长，并对未知浓度的溶液进行测定。

3、掌握双波长测定物质的方法。 二、实验内容和原理

内容：1、用紫外可见分光光度计测定K 2Cr 2O 7溶液标准曲线。

2、用紫外可见分光光度计测定叶绿素的含量。 原理：1、测定K 2Cr 2O 7溶液标准曲线

当光作用在物质上时，一部分被表面反射，一部份被物质吸收。改变入射光的波长时，不同物质对每种波长的光都有对对应的吸收程度（A ）或透过程度（T ），可以作出这种物质在实验波长范围内的吸收光谱曲线或透过光谱曲线。用紫外-可见分光光度计可以作出材料在紫外光区和可见光区的对紫外光和可见光的吸收光谱曲线或透过光谱曲线。根据比尔定律，某有色溶液的光密度D 与其浓度C 成正比，即D=KC 。

当溶液浓度以百分浓度为单位，且液层厚度为1 cm 时， K 称为该物质的比吸收系数。 2、测定叶绿素的含量 叶绿素的双波长定量测定：是根据叶绿素对某一特定波长的可见光的吸收，用公式计算出叶绿素含量。此法精确度高，还能在未经分离的情况下分别测出叶绿素a 和叶绿素b 的含量。

欲测定叶绿体色素混合提取植中叶绿素a 和叶绿素b 的含量，只需测定该提取物在某一定波长下的光密度D ，并根据叶绿素a 、叶绿素b 在该波长下的吸收系数即可求出叶绿素的浓度。为了排除类胡萝卜素的干扰，所用的单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a 和叶绿素b 在红光区的最大吸收峰分别位于663nm 和645nm ，又知在波长663nm 下，叶绿素a 和叶绿素b 的80% 丙酮溶液的比吸收数分别为82.04 和9.27，而在波长645nm 下，分别为16.75 和45.6。据此可列出光密度D 与浓度（单位mg/L ）的下列关系式：

D663 =82.04Ca + 9.27Cb (1) D645 = 16.75Ca+ 45.6Cb (2) 解方程式（1)、(2) 得：

Ca = 12.7D663 - 2.69D645 (3) Cb=22.9D645-4.68D663 (4) 将Ca 和Cb 相加，即得叶绿素总量CT ，即：

CT= Ca+ Cb=20.2 D645+8.02D663 (5)

另外，由于叶绿素a、叶绿素b在 652nm 处有相同的比吸收系数(均为34 .5)，也可在此波长下测定一次光密度(D652) 而求出叶绿素a 和叶绿素b 的总量，即

CT= D652×1000/34.5

三、主要仪器设备

紫外可见分光光度计、石英比色杯和玻璃比色杯（1cm）一套、移液枪（1~10mL、100~1000uL、20~200uL 等）、试管6只、容量瓶（50ml，1只）、烧杯、洗瓶、10ml试管研钵等

四、操作方法和实验步骤

1、K2Cr2O7溶液标准曲线制作

以母液100 mg/L K2Cr2O7溶液配制成浓度为5、10、15、20、25mg/L的标准样品，先确定测定K2Cr2O7溶液的波长，然后制作标准曲线，再根据标准曲线测定未知样品的浓度。配制成的标样的浓度梯度为5 mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L。

2、测定叶绿素含量

称取0.5g菠菜或生菜叶片，剪碎置于研钵中，加2ml丙酮研磨成匀浆，用80%丙酮定容至50ml,摇匀并放在避光处，2500r离心10分钟，取上清液测定。

以80%丙酮溶液作为空白对照，在645、652、663nm下读取叶绿素的光密度D663、D652、D645，根据公式计算叶绿素含量。

五、实验数据记录和处理

1、K2Cr2O7溶液标准曲线制作

K=14.3

未知样品吸光度值=0.266

未知样品浓度=18.6mg/L

D663 =82.04Ca + 9.27Cb

D645 = 16.75Ca+ 45.6Cb

Ca = 12.7D663 - 2.69D645

Cb=22.9D645-4.68D663

CT = Ca+ Cb=20.2 D645+8.02D663

Ca=12.12mg/L

Cb=6.24mg/L

CT = 18.36mg/L

CT= D652×1000/34.5

CT=18.8mg/L

六、实验结果与分析

1、K2Cr2O7溶液的吸光度值最大是在WL258.0处。

2、K2Cr2O7溶液的液层厚度为1 cm时，比例系数为14.3。

3、青菜的叶绿素总含量约为18.36~18.8mg/L左右。

4、实际测得的Chla：Chlb的比值为2:1，而实际上理论值应该为3：1，可能是由于在研磨时叶绿素没有被完全提取出来，或者由于细胞液以及其他液体的作用导致叶绿素部分分解。且光照也可能导致叶绿素分解，在实验时应该避光，提高实验准确率。

5、用Chla和Chlb相加计算所得的叶绿素总含量，和用波长为652nm处吸光度值算出的ChlT为1:1.2，有稳定的差，可能是由于在提取完毕后的叶绿体—丙酮溶液的最高吸收峰偏离理论吸收峰，由于实际吸收峰很陡，波长偏差1nm就可能对实验结构造成很大的影响。

七、讨论、心得

1、在进行K2Cr2O7的标准溶液测定时，需要先进行扫描。从200~800nm进行扫描，确定出吸收度最大的波长，再用那个波长进行K2Cr2O7的标准溶液测定。

2、测定青菜叶绿素时，不需要进行扫描，只需要直接测定WL645.0、WL652.0、WL663.0处的吸光度值。测定的时候可以重复测定几次再进行平均。

3、根据不同的计算和不同波长吸光度值，计算出的叶绿素总量会有一定的差别。

4、用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和叶绿素b来校正。

5、在叶绿素提取时采用避光，并减少研磨时间，加入碳酸钙保护叶绿素不被酸性物质破坏，同时加入石英砂帮助研磨，应该有助于叶绿素的提取。

6、为什么叶绿素吸收红光和蓝紫光？

叶绿素由基态上升到激发态需要吸收一定的能量，叶绿素分子吸收红光后，电子跃迁到最低激发态；吸收蓝光后,电子跃迁到比吸收红光更高的能级（较高激发态）。而光量子提供的能量要使叶绿素激发，就必须要满足那个能量值，而处于这个能量值范围的光为红光和蓝紫光，所以光吸收的是红光和蓝紫光。