第四章外植体的接种与培养
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第四章 外植体的接种和培养
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
措施
外植体的接种 培养方法 培养条件 外植体褐变及防止 试管苗的玻璃化现象及其预防
第一节 外植体的接种
一．接种室和净化工作台的消毒 二．外植体的接种
一．接种室和净化工作台消毒
1．紫外灯照射20分钟； 2．70%酒精喷雾空气； 3．台面酒精棉球擦洗；
培养过程中，培养物释放的微量的乙烯 和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养 物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害 培养物。
第四节 外植体褐变及防止
在组织培养中，常见到外植体由于褐变 （browning），产生致死性的褐化物， 不仅使培养基变褐，而且造成培养失败， 它已经成为组织培养中的一个棘手问题， 同时也成为植物快繁体系建立的一大障 碍。可以说褐变、菌类污染、和过度含 水（玻璃化）是组织培养中的三大难题， 尤其是褐变。
第五节 试管苗的玻璃化现象 及其预防措施
自从1981年Debergh等明确提出试植 物“玻璃化”（vitrification）概念以 来，发现在很多木本和草本试管植物中 都存在玻璃化现象。关于植物组织培养 中玻璃苗的成因和防止方法的研究已经 引起了人们的广泛注意，成为试管苗工 厂化生产中亟待解决的一个问题。
香石竹玻璃化试管苗
一．玻璃苗的形态解剖与生理特点
1.玻璃苗是植物组织培养中出现的半透明状的、畸 形的试管植物，不能够移栽成活。
二．影响褐变因素及防止措施
1．基因型：木本植物较草本植物易褐变。
2．外植体的生理状态：一般来说随着年龄和组织 木质化程度增加而褐变加强。
3．外植体的培养条件：取材料之前进行遮光处理 再切取外植体，则褐变减少，暗培养或低光照能减 轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。
4．培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养 时降低无机盐的浓度可减少褐变；6-BA增加褐变， 2.4-D和NAA减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸 钠、抗坏血酸、苏糖二硫醇等）可减少褐变；加入 吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。
有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形 成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分 化率。
一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少 的光。
2.光质
光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组 织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的 生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。 在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周 后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗， 11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝 光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见 愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。
蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象
一．褐变的原因
很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类 化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物 与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切 割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破， 酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶 便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。 醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体 的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。
第二节 培养方法
一．固体培养 二．液体培养
一．固体培养
固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用 浓度为0.6-1.0%（重量/体积）。固体 培养的最大优点是简单、方便。但缺点 是1）只有外植体的底部表面才能接触培 养基，吸收营养，上面则不能，影响生 长速度；2）外植体插入培养基后，气体 交换不畅，排泄的有害物质积累，造成 毒害；3）组织受光不均匀，细胞群生长 不一致。
我们实验室主要采用12h光照和12h黑暗。
三．培养基的pH
通常一般的培养基pH值都在5.6~6.0之 间。如pH值不适则直接影响外植体对营 养物质的吸收，进而影响外植体的脱分 化、增殖和器官的形成。不同植物对pH 的要求不同，如兰花要求pH值5.2或更 低一些，而玉米胚乳的组织培养在7.0时 愈伤组织的鲜重最快。
四．湿度
组织培养中的湿度影响有两方面：一是 培养容器内的湿度，它的湿度条件可常 保持在100%；二是培养室的湿度，它 的湿度变化较大。湿度过高或过低都不 利于组织培养。
五．ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和其它气体
氧是植物组织培养必需的。在接种时应 避免把整个外植体全部埋在琼脂中，以 免造成缺氧。培养瓶盖需要一定的透气 性。
不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和 实验才能掌握不同植物的培养规律。
在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影 响。
3.光周期
光周期对试管苗的增殖和分化的影响， 通常都选用一定的光周期来进行外植体 的组织培养，如一般都选用16h光照、 8h黑暗。这在组织培养前应搞清该植物 对光周期是否敏感。
二．光照
光照是组织培养中的重要外界条件之一， 它对外植体生长和分化有很大的影响， 表现在光照、光质和光周期等方面。
1.光照
有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如 玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽 的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎 只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。
二．外植体的接种
1．接种工具要经常在酒精灯上烧，防止交叉 感染；
2．烧后的接种工具要放冷却后才能用； 3．操作不能离超净台边缘太近，也不能太远； 4．外植体应按照要求在培养基的表面或内部
放好，不能让其在器皿中活动； 5．包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，
包扎好后才能从台面上移走。 6．接种时禁止谈话，防止咳嗽。
二．液体培养
静止滤纸桥培养 震荡培养。
静止滤纸桥培养
这种方法主要 用于胚培养和 愈伤组织培养 等，目前此法 不很普遍。
震荡培养
往复式摇床
自旋式培养架
第三节 培养条件
一．温度 二．光照 三．培养基的pH 四．湿度 五．氧和其它气体
一．温度
一般温度在25±2℃。通常低于15℃时， 外植体生长出现停滞，但高于35℃对生 长又不利。在促进芽发生时温度可略低 一些。
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
措施
外植体的接种 培养方法 培养条件 外植体褐变及防止 试管苗的玻璃化现象及其预防
第一节 外植体的接种
一．接种室和净化工作台的消毒 二．外植体的接种
一．接种室和净化工作台消毒
1．紫外灯照射20分钟； 2．70%酒精喷雾空气； 3．台面酒精棉球擦洗；
培养过程中，培养物释放的微量的乙烯 和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养 物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害 培养物。
第四节 外植体褐变及防止
在组织培养中，常见到外植体由于褐变 （browning），产生致死性的褐化物， 不仅使培养基变褐，而且造成培养失败， 它已经成为组织培养中的一个棘手问题， 同时也成为植物快繁体系建立的一大障 碍。可以说褐变、菌类污染、和过度含 水（玻璃化）是组织培养中的三大难题， 尤其是褐变。
第五节 试管苗的玻璃化现象 及其预防措施
自从1981年Debergh等明确提出试植 物“玻璃化”（vitrification）概念以 来，发现在很多木本和草本试管植物中 都存在玻璃化现象。关于植物组织培养 中玻璃苗的成因和防止方法的研究已经 引起了人们的广泛注意，成为试管苗工 厂化生产中亟待解决的一个问题。
香石竹玻璃化试管苗
一．玻璃苗的形态解剖与生理特点
1.玻璃苗是植物组织培养中出现的半透明状的、畸 形的试管植物，不能够移栽成活。
二．影响褐变因素及防止措施
1．基因型：木本植物较草本植物易褐变。
2．外植体的生理状态：一般来说随着年龄和组织 木质化程度增加而褐变加强。
3．外植体的培养条件：取材料之前进行遮光处理 再切取外植体，则褐变减少，暗培养或低光照能减 轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。
4．培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养 时降低无机盐的浓度可减少褐变；6-BA增加褐变， 2.4-D和NAA减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸 钠、抗坏血酸、苏糖二硫醇等）可减少褐变；加入 吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。
有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形 成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分 化率。
一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少 的光。
2.光质
光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组 织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的 生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。 在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周 后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗， 11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝 光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见 愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。
蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象
一．褐变的原因
很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类 化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物 与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切 割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破， 酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶 便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。 醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体 的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。
第二节 培养方法
一．固体培养 二．液体培养
一．固体培养
固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用 浓度为0.6-1.0%（重量/体积）。固体 培养的最大优点是简单、方便。但缺点 是1）只有外植体的底部表面才能接触培 养基，吸收营养，上面则不能，影响生 长速度；2）外植体插入培养基后，气体 交换不畅，排泄的有害物质积累，造成 毒害；3）组织受光不均匀，细胞群生长 不一致。
我们实验室主要采用12h光照和12h黑暗。
三．培养基的pH
通常一般的培养基pH值都在5.6~6.0之 间。如pH值不适则直接影响外植体对营 养物质的吸收，进而影响外植体的脱分 化、增殖和器官的形成。不同植物对pH 的要求不同，如兰花要求pH值5.2或更 低一些，而玉米胚乳的组织培养在7.0时 愈伤组织的鲜重最快。
四．湿度
组织培养中的湿度影响有两方面：一是 培养容器内的湿度，它的湿度条件可常 保持在100%；二是培养室的湿度，它 的湿度变化较大。湿度过高或过低都不 利于组织培养。
五．ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和其它气体
氧是植物组织培养必需的。在接种时应 避免把整个外植体全部埋在琼脂中，以 免造成缺氧。培养瓶盖需要一定的透气 性。
不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和 实验才能掌握不同植物的培养规律。
在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影 响。
3.光周期
光周期对试管苗的增殖和分化的影响， 通常都选用一定的光周期来进行外植体 的组织培养，如一般都选用16h光照、 8h黑暗。这在组织培养前应搞清该植物 对光周期是否敏感。
二．光照
光照是组织培养中的重要外界条件之一， 它对外植体生长和分化有很大的影响， 表现在光照、光质和光周期等方面。
1.光照
有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如 玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽 的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎 只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。
二．外植体的接种
1．接种工具要经常在酒精灯上烧，防止交叉 感染；
2．烧后的接种工具要放冷却后才能用； 3．操作不能离超净台边缘太近，也不能太远； 4．外植体应按照要求在培养基的表面或内部
放好，不能让其在器皿中活动； 5．包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，
包扎好后才能从台面上移走。 6．接种时禁止谈话，防止咳嗽。
二．液体培养
静止滤纸桥培养 震荡培养。
静止滤纸桥培养
这种方法主要 用于胚培养和 愈伤组织培养 等，目前此法 不很普遍。
震荡培养
往复式摇床
自旋式培养架
第三节 培养条件
一．温度 二．光照 三．培养基的pH 四．湿度 五．氧和其它气体
一．温度
一般温度在25±2℃。通常低于15℃时， 外植体生长出现停滞，但高于35℃对生 长又不利。在促进芽发生时温度可略低 一些。