PCR猪病诊断

聚合酶链反应（PCR）由美国Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis于1985年发明，并首次应用于人类基因遗传变异的研究[1]。随着Taq酶的应用和自动化扩增仪的发展，推动了PCR技术的普及应用，成为分子生物技术实验室中的首选方法之一，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，可在动物疫病诊断和检疫中用于微量样品的检测。特别是近年来，聚合酶链反应作为快速诊断疫病的重要手段，在许多禽病病毒的检测和诊断上得到了充分应用[2-5]。

一、PCR技术的基本原理

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板引物DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合、引物延伸合成DNA这三步构成一个PCR循环。每一个循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样DNA 的数量将以2n－2n的形式积累，在2小时内可扩增30（n）个循环，DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片断不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

二、PCR技术的特点

传统的动物疫病诊断方法有临床学诊断、生物学诊断、形态学诊断和免疫学诊断。随着分子生物学知识的不断积累，可能采用各种分子生物学技术直接探查病原体基因的存在和变异，从而对生物体的状态和疫病作出诊断，这就是基因诊断。在多种多样的基因诊断技术中，PCR因其巧妙的原理和与众不同的特点，已成为基因诊断的首选技术。现将其主要特点介绍如下：

1. 特异性高针对性强不仅可以检出正在繁殖生长的病原体，也可以捡出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染。尤其对那些目前尚不能体外培养和难以培养的

病原体，采用PCR检测特别有效。PCR技术是检测病原体的核酸，与生物化学和免疫学检测相比较，PCR结果与病原体培养结果更为一致。

2. 灵敏度高在PCR扩增中，靶序列的数目以指数极增长，样品中级微量的靶序列在数小时内即可增至几十万，甚至几百万倍，因此该方法的检测灵敏度极高。理论上推算可以检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。

3. 简便快速尤其是耐热TaqDNA聚合酶的应用和自动热循环仪的发展，使手工操作被自动化PCR取代。商品化试剂盒的发展和应用，使检测可在2－4小时内获得结果。

4. 对检测样品的要求低几乎所有的临床标本都可以作为PCR的材料。对病原微生物的检测，只要求标本中有完整的靶序列核酸。因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧标本，还是慢性或隐性感染的病料，都可以用于PCR扩增。

5. 安全检测病原体由于PCR操作的每一步都不需要活的病原体，不会造成病原体逃逸，在防止传染病扩散意义上具有安全性。

三、PCR技术在动物疫病诊断中的应用概况

对于疫病诊断的PCR技术，从诞生至今不到10年的时间里，已在生物学研究领域得到广泛的应用。将PCR技术应用于动物传染病的检疫研究也日趋广泛。例如，新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室负责对各种外来病的疫情监测诊断，该室在1992年建立了几项PCR检测技术，包括从结核病病灶中快速检测牛分枝杆菌；快速检测患病牛羊副结核分枝干菌；检测恶性卡它热和新城疫等。自1990年始我国成功地应用PCR诊断的疫病可归纳如下：蓝舌病、口蹄疫、牛病毒性腹泻、牛白血病、马鼻肺炎、恶性卡他热、伪狂犬病、狂犬病、非洲猪瘟、禽传染性支气管炎、禽传染性喉气管炎、马传染性肺炎、马立克氏病、牛冠状病、鱼传染性造血器官坏死病、轮状病毒、水道猫鱼病、水貂阿留申病、山羊关节病、梅迪－维斯纳病、猪细小病毒并、炭疽杆菌病、钩端螺旋体病、牛胎儿弯曲杆菌病、牛副结核病、致病性大肠杆菌、牛巴贝斯虫、弓形虫等病。现将以下几种疫病PCR技术应用状况具体介绍如下：

1. 应用PCR反应诊断魏氏梭菌病王三虎[6]等根据本研究建立的方法对牛粪便样品24份和兔粪便16份进行检测，结果表明与双抗夹心ELISA试验复合率为100％。每克粪便可捡出2×105个菌。根据魏氏梭菌ɑ毒素基因设计的一套引物，能够检测感染人和动物的所

有类型的魏氏梭菌，所以以此引物进行PCR，可用于人和动物的流行病学调查。本试验对PCR 产物进行测定，所得PCR产物与已知序列同源性为100％，排除了其他非特异性的可能。张小荣等应用PCR对2例由魏氏梭菌引起的山羊猝死症成功地进行了确诊[7]。研究证明该方法不仅诊断周期短、准确性高，而且省去了繁琐的动物实验，为动物猝死症的快速诊断开辟了一条新的途径。

2. 用半套式聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒S1基因[8] 本试验是在RT-PCR的基础上，在第1次PCR扩增产物序列的内侧设计1个新的引物XZ33并能与第1次PCR扩增中的1个引物XZ11组成1对内侧引物，组成半套式PCR，用该对引物分别对6个标准禽呼肠孤病毒（ARV）的PNA进行半套式PCR扩增，琼脂糖中电泳染色后，结果检测一条明显的392bp的PCR扩增条带，与DNA标准分子量对照分析，所扩增的DNA片段与实验设计预期大小相一致，而在同等条件下用这对引物对其它6种禽病病原核酸进行半套式PCR扩增，均未出现任何扩增条带，结果表明用该对引物进行半套式PCR扩增检测禽呼肠孤病毒是特异的，可用于ARV 的检测和鉴别。该方法的建立为ARV的流行病学的调查及开展分子生物学研究提供了快速手段。

3. 应用PCR技术检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体根据霉形体16rRNA的基因序列设计、合成了1对引物对鸡霉形体（MG）和鸡滑液囊霉形体（MS）菌株DNA进行PCR扩增，得到了与预期大小相一致的PCR产物，而这对引物对其他禽病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性。PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为2pg 和3pg。相当于2×102和2×103个菌，而常规的血清学或病原分离方法无法检出这样小的量。孟书霞等应用建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品[9]。从人工感染样品中均检测到MG，且于24h即可检测到阳性结果，说明PCR方法能对霉形体病进行早期诊断；对临床样品阳性检出率为10.25％，而常规分离培养的阳性率为2.8%。研究表明PCR技术不仅特异性强，而且敏感，可大大缩短检测时间，克服了常规培养的弊端，尤其适用于此病的早期感染和隐性感染的诊断。

4. 应用复合PCR技术检测猪圆环病毒复合PCR是一种特殊的PCR技术，即在统一反应体系中加入多对引物，扩增多个基因片段。猪圆环病毒（PCV）分两种血清型PCV-1和PCV-2。PCV-1无致病性，广泛存在于猪体内[10]。由于此病毒在细胞上不产生病变，因此分离病毒费力、耗时，不适于此病的快速诊断。卢银华[11]等在本研究中用3条引物扩增PCV的两种