成年大鼠心肌细胞的急性分离方法_韦丽兰

摘要
背景：获得存活率高、活性好的正常单个心肌细胞是心肌电生理研究的基础，寻求一种可以获得在形态、功能和结构上接 近于正常心肌细胞的实验方法具有重要意义。 目的：探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞过程中的各影响因素，建立一种可以稳定获取高活性心肌细胞的急性分离方法， 为心肌细胞电生理研究和分子生物学研究提供细胞。 方法：SD 大鼠颈椎脱臼，迅速开胸取心脏，将心脏悬挂于 Langendorff 装置上进行主动脉逆流灌流。先用无钙台式液灌流 5 min，然后换上酶液灌流消化 20 min，最后用终止液灌流 3 min 终止反应，将细胞置于 HK 液中保存。 结果与结论：可获得 60%~80%的横纹清晰，透亮的长杆状的心肌细胞。说明调节和控制细胞分离过程中的各影响因素可以 保证分离的心肌细胞的数量和质量。 关键词：心肌细胞；成年大鼠；分离；数量；影响因素 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.016
Supported by: the Science Foundation of Guangxi, No. 0728140*
Received: 2011-10-19 Accepted: 2011-12-21
0 引言
获得正常的单个心肌细胞是心肌电生理研 究的基础。而大多数研究用的细胞都来自培养 的新生鼠心脏，新生鼠的心肌细胞与成年鼠心 肌细胞在形态、结构、功能上存在很大的差异。 实际上成年鼠心肌细胞更具有科学价值。但成 年鼠心肌细胞的培养比较困难。
被运用于细胞分离以来，用酶解法分离心肌细 胞一直是最主要的方法。酶解法用于成年大鼠 的心肌细胞分离已有40年的历史，但至今仍 无统一的方法可循[7-8]。许多人在实验中对这 种方法进行的改进[9-10]，但分离后细胞的存活 率和钙耐受性总是不稳定。所以如何利用经 济，简便，有效，重复性好的方法，获得大量 具有正常生理功能的心肌细胞，提高细胞的存 活 率 等 [11-13] ， 都 是 心 肌 细 胞 分 离 中 的 关 键 问 题。
北京医 科大学龙西林等[1]于 1991年率先 在国内报道成年大鼠的心肌分离方法，迄今 为止也仅有少数单位初步建立了可用于原代 培养的心肌细胞分离方法[2-4]。有文献报道， 其培养时间最长可以为2周甚至1个月，且培 养过程中细胞的形态等一些特性均会发生改 变 [5] 。 自 从 1969年 Kono[6]首 次 报 道 了 酶 解 法
韦丽兰，莫书荣. 成年大鼠心肌细胞的急性分离方法[J].中国组织工程研究，2012，16(11): 1969-1972. [ ]
Department of Physiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Wei Li-lan★, Studying for master’s degree, Department of Physiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China weililanmic@
ห้องสมุดไป่ตู้
束后也用体积分数75%乙醇和纯水清洗系统， 确保其清洁。
细胞分离：大鼠腹腔注射肝素1 000 U/kg， 20 min后，颈椎脱臼，开胸取心脏，快速置于 4 ℃无钙台式液中洗掉部分血液，迅速将心脏 悬 挂 于 Langendorff 装 置 上 进 行 主 动 脉 逆 流 灌 流。首先，用无钙台式液灌流3~5 min，解离细 胞之间钙离子依赖的紧密连接，进一步洗净心 脏内血液。然后换上酶液灌流消化15~20 min， 待心肌组织变软，颜色变浅，换上终止液终止 消化3~5 min，清除酶液。灌流全程要持续通氧， 灌流流速均为8 mL/min，且全程要注意不能有 气泡进入心脏内。灌流液流出端口温度要始终 保持在37 ℃。消化完成后取下心脏，剪取心尖 部左心室，置于KB液中，通氧，用眼科剪将其 剪碎成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用吸 管轻轻吹打，用200目的滤网过滤去除残余组织 块，静置15 min，让细胞自然降沉，弃上清， 再加入KB液自然降沉，反复2次，将细胞在室 温下静置30 min，等待复钙。
Ⅱ型胶原酶 8 mg，BSA10 mg 加溶解于 40 mL 的无钙台式液
取 无 钙 台 式 液 50 mL 加 入 500 μL 2.0 mmol/L 的 CaCl2 溶液
酶溶液和终止液现配现用。所有溶液的配 制用超纯水或三蒸水。溶液使用前通体积分数 100%氧气10 min，使其氧饱和。
方法： 实验准备：准备好所有与实验相关的仪器和 器械。所有灌流液100%氧饱和10 min。37 ℃ 预 热 灌 流 系 统 ， 用 体 积 分 数 75% 乙 醇 灌 洗 10 min，再用超纯水灌洗10 min，每次实验结
1 材料和方法
设计：动物实验观察。 时间及地点：于2010-09/2011-10在广西 医科大学实验中心完成。 材料： 实验动物：健康成年SD大鼠13只，雌雄不 拘，体质量200~250 g，由广西医科大学动物中 心 提 供 ， 实 验 动 物 许 可 证 号 ： SCXK 桂 2009-0002，SPF级。实验过程中对动物的处 置 符 合 2009 年 《 Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。 主要试剂和仪器：
Corresponding author: Mo Shu-rong, , Professor, Department of Physiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China mosr@
Wei Li-lan, Mo Shu-rong
Abstract
BACKGROUND: To obtain high survival rate and good activity of the normal single myocardial cells is the basis of myocardial electrophysiology. It is important to find an experimental method which is close to the normal myocardial cells in morphology, function and structure. OBJECTIVE: To discuss the influence factors during emergent isolation of myocardial cells by using enzymatic method in rats and to build an emergent isolation method for stable obtaining myocardial cells to provide cells for myocardial electrophysiology and molecular biology. METHODS: The heart of Sprague-Dawley adult rats was rapidly excised after cervical dislocated and mounted on a Langendorff apparatus for aortic counter-current perfusion. It was perfused retrograde via the aorta for 5 minutes with calcium-free tyrode, and then perfused with collagenase dissolved in nominally calcium-free tyrode for 20 minutes. Ultimately calcium solution was perfused for 3 minutes. Then the rat ventricular cells were stored in HK solution. RESULTS AND CONCLUSION: Viability of freshly isolated myocardial cells which were rod-shaped with clear-striation was 60%-80%. It is shown that to adjust and control all the factors in the emergent isolation can ensure the quantity and quality of myocardial cells.
中国组织工程研究 第 16 卷 第 11 期 2012–03–11 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 11, 2012 Vol.16, No.11
成年大鼠心肌细胞的急性分离方法*★
韦丽兰，莫书荣
Emergent isolation of myocardial cells from adult rats
试剂及仪器
П型胶原酶 牛血清白蛋白，HEPES 葡 萄 糖 、 L- 谷 氨 酸 、
NaCl、KCl、KOH 、 CaCl2、MgCl2，6H2O、 EGTA 超纯水机 Langendorff 灌流系统 恒流泵 恒温水浴锅
倒置显微镜
来源
Gibeco Solarbio 均为国产分析纯
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有限公司 日本 OLYMPUS 公司
细胞分离液(mmol/L)的配制：
分离液