胰岛素制备

生物技术制药参考资料

09 级制药工程( 1)班叶溢民090219011

基因工程制备胰岛素

一、胰岛素的定义

胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激

而分泌的一种蛋白质激素。

二、目前临床使用的胰岛素来源

1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1 个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。

2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30 位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。

3、重组人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素) ：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi —nant human insulin ，rhI) 的方法

1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E. CO —)分别发酵生产人胰岛素(human insulin , hi)的

A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hl。这

一方法缺点较多，目前已较少使用；

2、用基因工程E. coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin , hPI),后经加工形成hl。E. coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hl这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋

白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；

3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表

达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1〜50 mg/L)，产量低。

因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的

表达策略I2 J,尤其是对E. CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E. coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E. coli发酵表

达(His)6 —Arg —Arg 一人胰岛素原［(His)6 —Arg —Arg —human proinsulin , PPh—PI］，后加工成hI的制备工艺。

四、基因工程制备胰岛素

1、提取目的基因：既从人的DNA 中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离。主要有如下4 种方法：

(1)鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA 分子杂交，即DNA 探针

(2)人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA 推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。

(3)从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用

(4)PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作……

2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。主要

有如下2 种方法：

（1碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于

酶切、PCR扩增、银染序列分析。

（2）煮沸法

3、基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA

连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。

4、将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，女口CaCI2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。

将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。

5、胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白

质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）

五、关于胰岛素制备的一些问题

人体是这么产生胰岛素的？

第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆

的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除

其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链---------- 胰岛素原（Proinsulin ）。胰岛素原随细胞浆中

的微泡进入高尔基体，连接上二硫键，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸

连接的链，断链生成没有作用的C肽，形成a链和B链的胰岛素，分泌到B细胞外，进入

血液循环中。

(Snustad et al. 1997)

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大肠杆菌没有高尔基体等细胞器，基因工程如何利用大肠杆菌合成胰岛素？

《微生物学教程》（周德庆）：1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使 E.coli

合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到 E.coli的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在 E.coli细胞内进行正常的复制和表达，从

而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体

外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

所以大肠杆菌产生的胰岛素，需要用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

大肠杆菌是原核生物，细胞器只有线粒体，但它有相关的酶在细胞质内。和蓝藻进行光合作用一样，蓝藻也没有叶绿体，但它可以合成相关的酶。因此，只需要细胞质就可以了！

1、合成胰岛素需要高尔基体和线粒体是对人或真核生物而言

2、原核生物的生长和发育也需要蛋白质，从哪里来的呢？当然是自身合成，

这说明原核生物合成蛋白质只需要线粒体和一些酶，当然还有能量人体产生胰岛素首先是一个基因转录成一个mRNA ，再翻译为一条肽链，这条肽链再