微核试验

一、意义和目的

•学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。

二、原理

•基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint )。

• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类:①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。其中③实际上指基因突变；④指染色体畸变。

•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l ／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。

• 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，故常计数PCE细胞中的微核，因为当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。

操作步骤

• 动物选择首选物种是小鼠和大鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。无首选品系，通常用实验室品系。

• 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。

• 染毒次数及取样时间不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4d，第5天取样。

操作步骤

• 剂量选择受试物的最大剂量除因溶解度所限外，应达最大耐受量，或参考毒物的LD50，以80％LD50为最高剂量。在一般情况下，应设4～5或更多试验组，剂量水平跨3个以上数量级。另设阳性和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50～100mg/Kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射一次或二次。阴性对照组使用等体积的溶剂。

操作步骤

• 骨髓液的制备和涂片可取胸骨或股骨的骨髓。

• 固定

将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。

• 染色

将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应用液染色10～15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

• 观察计数

操作步骤

观察计数

先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数，如染色得当，细胞核呈暗蓝色，PCE呈灰（淡）蓝色，NCE呈淡红色。此外，一般地PCE比NCE稍大稍圆。对所分析的每只动物，计数含微核的PCE数和每1000个PCE中含微核的PCE数（或微核PCE 千分数），并且计数200个红细胞中PCE数和PCE百分比（或PCE/NCE的比值）。

操作步骤

4.结果分析与评价

• 本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；

• 正常的PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.6～1.2)。如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如比值＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。

注意事项

• 操作时推制良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实验的关键步骤。

• 熟悉并正确区分各种骨髓细胞。__