抗生素类药物分析
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第十一章抗生素类药物分析
基本要求
学习要点
内容
第一节概述
一、特点:化学纯度较低, 同系物多,异构体多,降解物多,稳定性差。
二、鉴别方法:生物学法,理化方法。
三、特殊检查项目:异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌,组分分析,聚合物等。
四、含量测定或效价测定
(一)、微生物学法——通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。
其原理恰好与临床应用要求一致,更能确定抗生素的医疗价值。
1、对于分子结构复杂、多组分的抗生素,生物学法是首选的效价测定方法。
2、本法的优点:
灵敏、用量小,结果直观
适用范围广:纯度好的、差的制品,已知或新发现的抗生素均适用,同一类型的抗
生素不需分离,可一次测定其总效价。
3、缺点:
操作步骤多,测定时间长,误差大等。
(二)、理化方法——适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素。
1、本法的优点:
迅速、准确、有较高的专属性。
2、缺点:
对含有具同样官能团杂质的供试品不适用,或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时,所测得的结果,往往只能代表药物的总的含量,并不一定能代表抗生素的生物效价。
第二节β-内酰胺类抗生素
一、化学结构与性质
(一)、青霉素族
(二)、头孢菌素族
二、鉴别试验
(一)、呈色反应
1、羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用,β-内酰胺环破裂生成羟肟酸;在稀酸中与高铁离子呈色。
2、茚三酮反应
3、与重氮苯磺酸的偶合反应
4、硫酸-甲醛试验
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(二)、各种盐的反应
1、钾、钠离子的火焰反应
2、有机胺盐的特殊反应(如普鲁卡因青霉素的重氮化-偶合反应)
(三)、色谱法
1、高效液相色谱法(HPLC)
2、薄层色谱法(TLC)
3、中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。
(四)、光谱法
1、IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。
2、该类抗生素共有的特征峰:
1)、β-内酰胺环羰基的伸缩振动(1750~1800)
2)、仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1±,1525 cm-1±,1680 cm-1±)
3)、羧酸离子的伸缩振动(1600 cm-1±、1410 cm-1±)
3、UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物的最大吸收波长鉴定法。
三、特殊杂质的检查
本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物,有关物质,异构体等,一般采用HPLC法控制其量,也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。
(一)、聚合物——HPLC法
1、色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10(40~120?m)为填充剂,玻璃柱内
径1.3~1.5cm,床体积50~60mL;流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(取磷
酸氢二钠 2.19g和磷酸二氢钠0.54g,加水1000mL使溶解,调节pH值至7.0),流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液;流速为每分钟1mL;检测波长为254nm。以流动相A为流动相,用1mg/mL
蓝色葡聚糖2000溶液进样200?L进行测定,理论板数应不低于900,拖尾因子在0.75~1.5,对照品溶液以流动相B为流动相,重复进样200?L,峰面积值的相对标准差应小于 5.0%。
2、对照品溶液的制备取头孢他啶对照品适量,精密称定,加水制成含头孢他啶
100ug/1mL的溶液,摇匀。
3、测定法取本品适量,精密称定,加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液,立即进样200uL,以流动相A为流动相进行测定,记录色谱图;另取对照品溶液200uL注入液相色谱仪,
以流动相B为流动相,记录色谱图,按外标法计算,本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过
0.3%。
4、自身对照外标法的原理:
1)、该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱
行为的缔合物,即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。
2)、以药物自身为对照品,测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标;
3)、然后改变色谱条件,测定样品,记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响
应指标,
4)、按外标法计算,即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。
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(二)、有关物质和异构体
1、例 1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查:
>>色谱条件与系统适用性试验:要求头孢呋辛酯A,B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度R﹥1.5;理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算,n ≥1500。
>>异构体——照含量测定项下方法试验。以A异构体峰的相对tR为1.0,B异构体峰的相对tR约为0.85,
>>供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48~0.55。
>>有关物质——按自身对照法测定有关物质限量
2、△2-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得的,其相对tR约为 1.2 。
(三)、吸收度
1、如青霉素钠(钾)的吸收度检查: