植物细胞工程理论1

第一章 植物细胞全能性与形态发生教学目标 (1)掌握细胞离体培养的基本理论；(2)掌握培养条件下组织细胞脱分化和再分化的调控原理；(3)掌握植物的离体器官发生；(4)掌握体细胞胚胎发生与人工种子；(5)了解“挑战杯”获奖作品“红掌气生根再生快繁体系建立”研究的全过程培养学生的创新精神；(6)介绍相关科研论文的研究结果培养学生的科研意识。

引言 植物细胞工程的理论基础是植物细胞全能性，所以深入理解植物细胞全能性及其表达与调控对学习理解后几章内容非常重要，本章作为重点章节介绍。

一、植物细胞全能性（totipotency）的概念植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下能发育成完整的植株。

把这种生活的植物细胞所具有的产生完整植株的潜在能力称为植物细胞全能性。

植物细胞按分裂能力分为3类（参照动物细胞分类类型）：①周期细胞：始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期，包括茎尖、根尖及形成层细胞。

②终端分化细胞：永久失去分裂能力的细胞，包括筛管导管、气孔保卫细胞等特化细胞。

③Go细胞：一般不分裂，但当受到外界刺激时可重新启动分裂，包括表皮细胞及薄壁细胞。

一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它的分化程度。

差异：1、受精卵的全能性最高 2、受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。

植物细胞只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力，其回复过程取决于该细胞原来所处的自然部位、生理状态和外部环境条件。

营养生长中心 形成层细胞 伴胞及分泌细胞 薄壁细胞 厚壁细胞 纤维细胞 筛管不同类型细胞脱分化可能达到的程度根据细胞类型不同从强到弱：营养生长中心〉形成层〉薄壁细胞〉厚壁细胞（木质化细胞）〉特化细胞（筛管、导管细胞）；根据细胞所处的组织不同从强到弱：顶端分生组织〉居间分生组织〉侧生分生组织〉薄壁组织（基本组织）〉厚角组织〉输导组织〉厚壁组织。

正因为许多类型的细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体或植株。

所以①在细胞水平上进行的任何遗传操作，通过细胞培养和植株再生，最终可将细胞的遗传修饰变以植物的遗传修饰，从而改变了整个植物的遗传特性。

②植物细胞全能性使得它们能够在培养条件下无限的分裂和增殖，这样可以利用植物细胞的大量培养的方法，使它们像微生物一样，在生物反应器中生产有用的化合物。

因此细胞全能性学说是细胞工程的理论基础。

二、植物细胞全能性的表达（一）植物细胞全能性表达所需条件：基本条件有2个：①细胞或组织脱离母体（离体损伤刺激）：要使植物组织或细胞经脱分化再生植株，必须从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，即处于离体条件(正常植株叶片上不会再长植株或愈伤组织)。

损伤刺激会使细胞呼吸速度增大，称为“损伤呼吸”，酶的活性增加，代谢物含量变化。

②激素的调控（营养物质和激素的刺激）细胞离体后以异养方式生存，所以必须供给营养物质（培养基）。

还必须供给激素刺激，以打破抑制力，恢复细胞分裂。

抑制假说：认为静止细胞仍然保存着在分生组织状态时的那种细胞分裂潜能，只不过存在一种抑制物质或抑制力，使细胞分裂能力不能表现。

如果去除这种抑制，细胞就恢复到分裂状态。

这种抑制剂的作用原理及作用位点尚不清楚，但其抑制效能可能会在生长调节物质（激素）的作用下而失掉，从而使细胞恢复分裂能力，实现脱分化。

不同植物细胞内，抑制剂的质和量可能是不同的。

因此在离体培养中，往往因植物不同培养基中添加激素的种类和浓度以及配比也不同。

激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。

此外，GA3、AB A、乙烯等也在细胞分化中起到一定的调节作用。

③还有光照和温度的影响一般需要在黑暗条件下诱导愈伤组织；也有植物在光照条件下诱导愈伤组织。

对温度的要求培养温度较高（如甘薯）；而耐低温植物，培养温度较低。

一般植物培养温度在25℃左右。

（二）植物细胞全能性的表达过程:离体培养条件下，植物细胞全能性的表达（过程）是通过细胞脱分化与再分化实现的。

1、脱分化（1）分化〔differentiation〕：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

（许智宏，1998）（2）脱分化〔dedifferentiation〕：指已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态并形成没有组织结构的细胞团（未分化的愈伤组织）的现象。

还可表述为具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。

静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。

（3）细胞脱分化过程中细胞结构的变化植物体内最大量的分化细胞是成熟的薄壁细胞，如叶肉细胞、表皮细胞、内皮层和髓部的薄壁细胞等，它们在形态上与分生细胞有明显的区别。

即其细胞及其核的体积较大，核位于细胞边缘，细胞中央有一个大的液泡，细胞质内核糖体密度较低，多聚核糖体数目很少，质体为分化程度较高的叶绿体、杂色体、白色体或淀粉体。

在离体培养条件下成熟的薄壁细胞从第一次分裂开始即进入脱分化的过程。

通过几次有丝分裂新生的细胞逐步转变为分生状态的细胞。

脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。

最终具有分生细胞的特点：细胞体积较小，细胞核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞质显著变浓，大液泡消失，细胞器增加，液泡蛋白体的出现和叶绿体转变为原质体。

细胞脱分化的重要特征:1、液泡蛋白体的出现如烟草叶肉栅栏细胞从培养20h起直到培养3～4d，脱分化细胞的液泡中陆续出现电子密度很高的圆球体。

放射自显影研究表明，标记的亮氨酸能渗透到这种圆球体中，证明它是一种蛋白体（PB）。

单独用锇酸固定时，电子致密体可被完整地保存下来。

如只用戊二醛固定，它们虽然也可固定下来，但其内部呈现网状结构，表明具有一些不能被戊二醛固定的物质。

电子致密体对固定剂的反应说明，它除了含有能被醛固定的蛋白质外，还含有一些能被锇酸固定但不被醛类固定的物质，如脂类等。

同时还可以看到在液泡中有一些新形成的球形细胞质团（NCM），其大小和外形与蛋白体十分相似，并经常与后者相连结。

这些新形成的球形的细胞质团中多聚核糖体的数目很多，说明处于合成代谢活跃的状态。

这种不寻常的电子显微图像给人的印象是，在蛋白体的基础上可以形成新的细胞质团，实现细胞质的改组。

因此朱至清认为蛋白体的出现和细胞质的旺盛生长是烟草叶肉细胞开始脱分化的重要标志。

2、质体转变为原质体脱分化过程中细胞质改组的另一个重要方面是细胞器的变化，变化最明显的是叶绿体。

随着脱分化过程的进行，叶绿体内淀粉粒逐渐增多，有的几乎充满叶绿体的整个空间，叶绿体开始以缢裂方式分裂，随着分裂次数的增加，叶绿体的体积逐渐减小，片层退化和消失，变成只含有淀粉粒的淀粉体。

淀粉体中的淀粉被消耗后，最终变成原质体。

脱分化过程中线粒体、微体、高尔基体和粗面型内质网明显增多，胞质电子密度加大，这些胞质结构的变化显示细胞代谢非常活跃。

细胞脱分化过程包括3各阶段：启动阶段：细胞质变浓，液泡蛋白体出现。

演变阶段：细胞核移向中央，质体演变成原质体。

终结期：恢复到分生状态，细胞分裂即将开始。

(4)细胞分裂与愈伤组织形成：成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。

有时组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。

愈伤组织〔callus〕：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则无序生长状态的薄壁细胞，多在外植体切面上产生。

（5）愈伤组织的生长：经脱分化 导致 结果细胞――→具备了分裂能力――→细胞不断增殖――→愈伤组织的生长愈伤组织的生长并非一致进行，待细胞分裂到一定时期，便会停止分裂。

但如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养，可维持其活跃生长。

利用此特点，进行继代培养，可大量增殖。

也有例外，有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。

(6)脱分化影响因素：A.植物种类、组织和细胞状态有关：单子叶植物和裸子植物比双子叶植物难；本植物比草本植物难。

成年植物组织和细胞比幼年组织和细胞难；B.植物激素C.光照2、再分化（1）再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下又转变为各种不同类型细胞的现象。

离体培养物可以由脱分化状态再度分化。

包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。

（2）极性与细胞分化极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。

极性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。

极性一旦建立，在一般情况下不可逆转。

通常细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）。

（3）TE细胞分化作为维管系统的主要成分，管状分子（tracheary elements，TEs）在维管系统的形成中具有中心作用。

在植物系统发育条件下，TEs由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。

在离体培养条件下，TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成，这也是愈伤组织细胞分化器官的前提。

离体培养中，通常把TE细胞的出现作为组织分化的标志。

（4）组织分化在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织。

其中，拟分生组织和维管组织是两种重要的组织。

是形成不定芽和不定根的基础。

拟分生组织：是脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小的类似分生组织的细胞群。

也叫做生长中心或分生组织结节。

拟分生组织可以从一个细胞或几个细胞形成，可以起源于愈伤组织的表面，也可以起源于组织内部。

拟分生组织形成的同时或稍后，愈伤组织中会分化出维管组织（结节）。

维管组织（结节）：一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合结构（类似形成层），这种形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成芽原基或根原基。

（5）植株再分化途径：↗ 器官发生↘组织、器官 ↘ 胚胎发生↗ 再生植株到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中激素的种类、浓度及配比三、器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

（一）离体培养中器官发生的方式通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：①先芽后根 ②先根后芽 ③根芽同长（二）器官分化过程1、经过愈伤组织再分化器官的过程：离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过3个生长阶段。

第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。

第二阶段是“生长中心”形成。

当愈伤组织转移到利于有序生长的条件下时，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。

第三阶段是器官原基及器官形成。

2、不经过愈伤组织再分化器官的方式：有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。