限制性内切酶
限制性内切酶原理
AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
5’NNGCGGCCGC NN3‘ 3’NNCGCCGGCGNN 5 ‘
5’NNNGC-OH P-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ‘
Hsp70A ：Ex-F 5' CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3'
Nde I Hsp70A ：Ex-R 5' GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'
Not I
4 DNA甲基化酶
甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲 硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可 形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。
特殊的II型限制酶
有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
影响限制性酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）
粘性末端和平末端
II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端 分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶 在基因工程中应用最多。
限制性核酸内切酶
生理意义
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护 机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受 到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中 可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但 并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对 DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶 切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化 DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切 割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感 性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限 制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type Ⅱ) 及第三型(Type Ⅲ)。
类型
第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别 (recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离 识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文 序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗 传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
4.1.1 限制性内切酶
限制性内切酶LOGOE. coli KE. coli C EOP=1EOP=1EOP=1EOP=10-4E.coli K E.coli B E.coli CλC11110-410-410-410-411λK λB1963年以来，Arber及其同事发现 ，经同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随着其DNA的降解，但宿主自身的DNA不被降解。
Arber的解释：通过噬菌体感染进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰而免于被分解。
1965 年，Arber预言有限制性内切酶的存在发现1968年Messelson首次从E.coli K中分离限制性内切酶 Eco K①需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等②有特定的识别位点 ，但没有特定的切割位点③切割位点远离识别位点1000bp以上1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 细胞提取液能迅速降解外源的噬菌体DNA ，但不能降解自身DNA ，这就是Hin dII酶。
Nathans等人立即查明了限制内切酶的有效性，并将其用来分析 DNA 的结构。
1978 H.Smith， W Arber和D Nathans由于限制性内切酶发现和应用的研究得到诺贝尔奖。
命名限制酶的命名最初由Smith和Nathans于1973年提出，1980年再由Roberts进行系统化和分类，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。
1、来源菌属名的首字母和其种名的头两个字母形成的三个字母缩写来表示。
2、用一个字母表示菌株或类型。
3、用罗马字母表示不同的限制与修饰体系。
如Eco RI（Escherichia coli ）种类根据限制酶识别切割特性，催化条件，及是否有修饰酶活性分三类(I, II ,III) 。
也有分四类，IIs类，即II 亚类。
type Ⅰ（数量少，约占1%）特点：（1）属复合酶类，兼具修饰和切割DNA两种特性。
3限制性内切酶
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心 机上短暂离心。 ３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小 时。 ４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer 以终止反应。 ５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２ 小时。
３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如 EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有 如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比 来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
实验方法
１．按下表分别加入各试剂（注意限制性 内切酶最后加入且在冰上操作）于 Eppendorf管中。 DNA 5μl 10×buffer 1μl 无菌水 3.5μl 内切酶 0.5μl 总体积： 10μl
酶切反应中应注意以下几个问题：
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底 物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对 ２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 使用时防止操作中对内切酶的污染。
２．ＤＮＡ：
限制性内切酶
生技2班 张维嘉 楼辉辉 梁竟一 冯夏艳 孟慧 毛荣 殷智强
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制 酶分为三种类型，分别是第一型、第二型及第三型。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基 化的DNA的水解； Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解； III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基 序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的ype II restriction enzyme ） 识别序列： 5'GGGCC^C 3‘ BamHI（类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5' C^TCGAG 3'
限制性内切酶
4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而
在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶
降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作
用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶
。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
用 20 单位（Units）限制酶切割 1g 标记的寡核苷酸做测试时，发现 不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表 2-3）。相对来说， EcoRⅠ 对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在 2 小时的切割活性可达 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 对两端的序列长度要 求较大。
2020/4/27
2020/4/27
定义和命名
• DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列 的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切 断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之 失去活力，但对自己的DNA却无损害作用， 这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB
。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于
酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、
hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基
因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部 分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G
Y=C 或 T
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
星型活性的概念、原因和控制
星型活性的概念、原因和控制引言限制性内切酶（Restriction endonuclease）是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶，它们在分子生物学和遗传工程中有着广泛的应用。
限制性内切酶通常具有很高的专一性，只能切割与其识别位点完全相同的序列。
然而，在某些反应条件变化时，酶的专一性发生改变，导致酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星型活性（star activity）。
星型活性可能是内切酶的一种普遍特性，如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。
星型活性的出现会影响DNA分子的结构和功能，例如DNA复制、修复、重组、转录等过程。
星型活性也会干扰限制性内切酶在分子生物学和遗传工程中的应用，例如DNA克隆、组装、分析等操作。
本文将介绍星型活性的概念、原因和控制方法，以帮助读者了解和避免这一现象。
星型活性的概念星型活性是指同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时，酶的专一性发生改变，导致酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
星型活性是由于内切酶与DNA之间的相互作用受到反应条件的影响而发生的。
内切酶与DNA之间的相互作用包括以下几个方面：•DNA序列：内切酶能够识别并结合特定的DNA序列，称为识别位点或限制位点。
识别位点通常为4～8个碱基对组成的回文序列或非回文序列。
•DNA结构：内切酶能够感知并适应DNA分子的空间结构，例如双螺旋、单螺旋、弯曲、超螺旋等。
内切酶与DNA结合时，可能会引起DNA分子的变形或扭曲，以便于切割。
•酶结构：内切酶由一个或多个亚基组成，每个亚基都有一个或多个结构域，负责不同的功能。
例如，催化域负责催化水解反应，识别域负责识别DNA序列，调节域负责调节酶活性等。
•酶动力学：内切酶与DNA之间的相互作用是一个动态的过程，涉及到结合、解离、迁移、转换等步骤。
内切酶与DNA之间存在一个平衡状态，称为Michaelis-Menten复合物（ES复合物），当达到这个状态时，酶的活性达到最大。
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶（Restriction enzyme）是一类由细菌产生的酶，主要作用是切割DNA分子特定的酶切位点。
限制性内切酶在遗传工程和分子生物学研究中被广泛应用，能够将长的DNA 分子切割成特定大小的片段，从而使得研究者能够更好地研究和操作DNA。
限制性内切酶的发现和研究起源于1970年代。
当时，研究人员发现一些特定的细菌能够产生一种奇特的酶，它对DNA分子具有特异性的切割作用。
这种切割作用通常发生在特定的核苷酸序列上，被称为酶切位点或限制性位点。
每个限制性内切酶所识别和切割的酶切位点都有其独特的序列特征，并且有许多不同类型的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
限制性内切酶的酶切作用是通过切割DNA分子的磷酸二酯键来实现的。
酶在酶切位点附近结合DNA分子，然后通过水解反应切割两股DNA的骨架，形成切割产物。
限制性内切酶的切割位置对两股DNA是对称的，意味着切割产物的两端都有一小段单链的“黏性末端”。
这种黏性末端的单链序列是由酶切位点的一部分序列决定的，如EcoRI酶切产生的末端序列是5'-GAATTC-3'。
黏性末端可以与其他黏性末端互补配对，形成DNA双链的黏性连接。
这种黏性连接有助于分子生物学研究者将DNA分子重新连在一起，或者将不同的DNA分子连接在一起，从而构建新的DNA分子。
限制性内切酶的应用非常广泛。
一方面，通过限制性内切酶的切割作用，可以将长的DNA分子切割成小片段，从而方便进行测序、克隆和分析。
另一方面，限制性内切酶可以用于DNA重组和基因工程。
研究人员可以利用黏性末端的互补配对原理，将不同的DNA片段连在一起，构建新的DNA分子，例如将外源基因插入到质粒中，形成重组DNA分子。
此外，限制性内切酶还可以用于DNA分子的鉴定和分析，例如通过切割产物的大小和形态来鉴定特定的DNA序列。
总之，限制性内切酶是一种重要的分子工具，广泛应用于分子生物学研究、遗传工程和基因工程等领域。
限制性内切酶和DNA体外重组的基本含义
• 1、基本概念
•DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把 一个生物体中的遗传信息转入另一个生物体。
2、基本步骤
•目的基因的提取:供体生物基因
或称外源基因的提取 •限制性酶切：目的基因切成不同 大小的片段 •酶接：连接到另一DNA分子上 （克隆载体） •转化:将这个重组DNA分子转入 受体细胞 •筛选和鉴定:对吸收了重组DNA 的受体细胞进行 筛选和鉴定 •基因表达：进行培养，检测外援 基因是否表达。
１、甘油浓度过高「＞5%v/v」 ２、１μｇDNA相对应的酶Unit数过高（因酶不同而不同，一般＞100 Unit/μｇ）
３、离子强度低（＜25mM）
４、pH值高（＞pH8.0） ５、残存有机溶剂。 ６、Mg2+替换为其他二价离子。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）
Star 活性を阻害する条件
１、在切断可能的范围内，尽量减少酶用量。 ２、确认完全除去制备DNA时的有机溶剂。 ３、反应溶剂的离子强度调至100-150mM。４、反应溶液的pH值调整到7。 ５、二价阳离子尽量使用Mg2+。
2、Klenow酶：
• 也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’ 外切酶活性
Kpn I
5'- GGTACC -3' 3'- CCATG G -5'
Asp718 I
GTБайду номын сангаасCC-3' 5'-G + G-5' 3'-CCATG
CTCGA G
CCC
1 Unit 定义： 限制性内切酶在50μL反应液中60分钟完 全切断1μg DNA（多数情况是λ噬菌体DNA ）。
限制性内切酶的发现
酶分子
I类酶
II类酶
三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离
III类酶 二亚基双 能
识别位点 二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列
切割位点 距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点 在识别位点 下游24-26bp
限制性反应 互斥 与甲基化反应
分开反应
同时竟争
限制作用 需要ATP 需要
需要
不需要
五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔
1）I类酶，EcoK，EcoB。 （1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特
异性位点识别活性。
（2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S—腺 苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。
（3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态， 酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活 性，或限制, 或限修饰，或不限制不限修饰
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点， 将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR基因位点）
3） hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点 的碱基甲基化反应。
4） hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内Hale Waihona Puke 酶和甲基 化酶，识别特殊的作用位点。
六．甲基化酶的基本特征：
1)Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴， a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱 基甲基化，封闭酶切口。
b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶 切口。
c) DNA腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶 Dcm
七．酶切图谱示意图
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶又称为限制性内切酶是一种由特定的特定的特定的核酸分子特定的特定位置所识别的酶，它们能够在特定的位置将核酸分子切割成两段，其中一段被称为内切片段，另一段称为外切片段。
限制性内切酶是 DNA变，特别是基因识别和修饰的重要工具，可以将 DNA子切割成两个不同的片段，并且这两个片段可以通过结合的方式来进行重新组合。
限制性内切酶的发现，极大地改变了分子生物学的研究领域，使得科学家们能够更加精确地控制DNA的改变和组装。
限制性内切酶的种类繁多，但它们共有的特点是精确地识别特定DNA片段，并在特定的位置进行限制性切割。
它们曾被广泛应用于全基因组比较、基因调控分析、基因组编辑、克隆方法开发、细胞工程和一些其他的生物科学研究。
限制性内切酶的分解模式是其特有的特征，它们能够在特定的位置精确地分解DNA，使反应具有高度特异性。
它们的作用位置是由特定的DNA序列所决定的，即所谓的“限制性位点”。
它们的分解效率较高，一旦识别了特定的DNA序列，就可以把DNA分解成外切片段和内切片段。
此外，限制性内切酶的精确度也是非常高的，因为它们在DNA分解过程中只在特定的位置进行切割，从而避免了偶然的外切。
另外，限制性内切酶具有一定的灵活性，可以通过增加弱底物吸引力或结合抑制剂来改变它们的功能，以及通过改变活性中心的位点，以改变它们的切割效率。
总之，限制性内切酶因其精确度、分解效率和灵活性而能够大大的改变分子生物学的研究领域。
限制性内切酶在生物领域的应用非常广泛，它们可以用于克隆基因和生物工程，用于分析基因组变异和基因组间水平的比较，和用于细胞工程中细胞表型的改变。
此外，限制性内切酶也被用于生物检测，特别是对病毒感染有重要意义。
比如可以利用限制性内切酶对病毒DNA进行检测，以及其他一些生物标记试剂的检测，以确定特定的细胞和细菌的存在。
另外，限制性内切酶也可以应用于药物开发，用于研究药物潜在的重要靶标，以及如何从DNA中提取药物起始分子。
限制性内切酶和引物
子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好
不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
• 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。
引物二级结构
• 引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多
碱基互补
• 发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则
将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
• 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个
碱基与模板DNA均需严格配对，不能进
行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，
甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码
引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
– 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 – 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物Tm值
• 一般要求：55℃-65℃。 • 计算：
– 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 – 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它的功能是能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶(简称限制性内切酶或限制酶)。
它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNae），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶，基因工程最常用也是高中生物所指的限制性核酸内切酶即为Ⅱ型酶。
新课标高中生物必修2――遗传与进化模块中“基因工程及其应用”这一节对限制性核酸内切酶作了一定的介绍，但笔者在教学过程中发现部分学生概念有些模糊，做题准确率不高。
因此笔者总结了有关限制性核酸内切酶的知识点，并结合近年来的高考真题，对该酶作一次较为详细的总结。
1.限制性核酸内切酶的相关知识点限制性核酸内切酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。
一般情况下，不同的限制性核酸内切酶具有不同的识别序列和酶切位点。
但这并非绝对，部分限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，但切割的位点不同，如某maI和SmaI都识别六核苷酸CCCGGG，然而它们的酶切位点分别是C↓CCGGG和CCC↓GGG；有些限制性核酸内切酶不但具有相同的识别序列，连酶切位点都一样，如BamHI、BglⅡ、BtI这三种酶，它们的识别序列及切割位点都为G↓GATCC。
不同的限制性核酸内切酶切割双链DNA所形成的末端通常是不同的，有的酶切割后切口是平的，即形成平末端，如AluⅠ和HaeⅢ。
有的切口可带有一个短的单链末端，即黏性末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。
有些限制性核酸内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI(G↓GATCC)和BglⅡ(A↓GATCT)，由此产生的DNA片段可借黏性末端相互连接，使DNA重组在操作时具有更大的灵活性。
限制性内切酶消化技术的使用中常见问题
限制性内切酶消化技术的使用中常见问题引言：限制性内切酶消化技术是生物学研究和分子生物学实验中常用的一项技术。
通过切割DNA分子，限制性内切酶消化技术可以实现DNA的分离、测序、重组和修饰等多种用途。
然而，在使用限制性内切酶消化技术的过程中，也会遇到一些常见问题。
本文将针对这些问题进行详细阐述，并提供相应的解决方法。
问题一：限制性内切酶未能有效切割目标DNA在进行限制性内切酶消化反应时，有时会出现限制性内切酶未能完全切割目标DNA的情况。
这可能是由于以下原因造成的：1. 酶活性损失：限制性内切酶的活性受多种因素影响，如pH值、温度、离子浓度等。
在使用限制性内切酶之前，应确保其活性没有受到损害。
可以通过进行阳性对照实验，或者使用已被证实具有良好活性的酶来验证。
2. 酶切位点序列变异：限制性内切酶只能识别并切割特定的DNA序列。
若目标DNA序列中的限制性内切酶切割位点发生变异或缺失，将导致酶无法正常切割。
可以通过测序目标DNA来验证切割位点是否存在变异。
解决方法：1. 确认酶的活性：使用阳性对照实验或者使用已被证实具有良好活性的限制性内切酶来验证其活性。
2. 验证切割位点序列：通过测序目标DNA来验证切割位点的序列，确保其与限制性内切酶的切割位点一致。
问题二：限制性内切酶反应产物异常在进行限制性内切酶消化反应后，有时反应产物会出现异常的情况，如模板DNA完全被切割或完全未切割。
这可能是由于以下原因造成的：1. 反应条件不合适：反应缓冲液的pH值、离子浓度和温度等因素都会影响限制性内切酶的活性。
若反应条件不合适，将导致限制性内切酶无法正常切割目标DNA。
2. 酶过多或过少：限制性内切酶的用量应根据目标DNA的长度和预测切割位点来确定。
若酶用量过多或过少，会导致反应产物异常。
解决方法：1. 优化反应条件：通过调整反应缓冲液的pH值、离子浓度和温度等因素，优化反应条件，确保限制性内切酶能够正常切割目标DNA。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
23
Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
22
五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
限制性内切酶
1，发现
限制性内切酶能保护细菌不受噬菌体的感染，行使微生物免疫功能，缺乏限制性内切酶的大肠杆菌极易被噬菌体感染，但是如果拥有限制性内切酶，被感染的几率就会降低。
限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌几乎都能编码限制性内切酶。
2，限制-修饰（R-M）系统
大多数限制性内切酶常常伴随有一两种修饰酶（DNA甲基化酶），从而保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。
修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。
甲基化所形成的甲基基团能够伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋的大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用，即组成R-M系统。
在R-M系统中，有些限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，独立行使自己的功能，有些本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同的亚基或同一亚基的不同结构域分别执行自己的功能。
3，分类
最常用的II型限制性内切酶，能够在识别序列内部或附近特异性的切开DNA链，产生特性的片段和凝胶电泳条带，是唯一一类能用于DNA分析和克隆的限制性内切酶。
限制性内切酶切割后产生一个3-羟基和5-磷酸基，只有当镁离子存在时才具有活性，而相应的修饰酶则需要S-腺苷甲硫氨酸的存在。
备注：
NEBuffer: Tris-HCl , MgCl, DTT（二硫苏糖醇，强还原剂）
星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，称为星号活性。
使用高保真内切酶，即经过基因工程改造降低了星号活性。
同裂酶：识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶，第一个被发现的内切酶称为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称为原酶的内裂酶。
4，甲基化
（1）原核生物甲基化
在原核生物中，DNA甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。
Dam甲基化酶：G m ATC
Dcm甲基化酶：C m CAGG和C m CTGG
例如，从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA则不能被识别序列为GA TC的限制性内切酶所切割，但是被Dam甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去甲基化，及将DNA转入至dam-的菌种中进行增殖。
（2）真核生物甲基化
CpG甲基化酶：m CG。