标准曲线的可靠性试验-→6药品与鲎试剂相容性的初筛试验-→7

英国Lab Kinetics 公司
ATi-320动态试管仪, 32孔，可变波长
BET － 72 型 细 菌 内 毒 素 检查法（定量法用）测定 仪（天大天发科技有限公 司研制 )
（二）光度测定法的实验程序 1 试剂仪器用具等的试验准备－→ 2 研定药品细菌内毒素的限值（L）－→ 3 选择定量鲎试剂－→ 4 计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最 低有效浓度（MVC）－→
试验 通常在干扰试验进行之前先做药品与鲎试 剂相容性的初筛试验[目的：确定供试品无干扰 的稀释倍数范围（或浓度范围）]。其初筛试验 程序是：
(1) 记录: ①供试品名称、浓度C（或干粉重量及 溶解后浓度C）； ②最大人体剂量M (查阅中国 药典、USP、EP或有关研究药品鲎试验的文献)
(2) 计 算 供 试 品 的 内 毒 素 限 值 L=K/M 。 (3) 选择试剂：①TAL或LAL（抗干扰能力、缓 冲能力、灵敏度、阴性控制、溶解性等）； ② BET 水 （ 内 毒 素 含 量 小 于 0.005Eu/ml ） ； ③ RSE或CSE（经RSE标化）；
(8) 制备： ① 标准内毒素系列（用BET水稀 释的内毒素标准溶液）；② NPC稀释系列 （不含内毒素的供试品稀释系列）；③ PPC稀 释系列(含标准曲线中点浓度内毒素λm的供试 品稀释系列)
(9) 反应： 在ATi系统或BET－72型测定仪的反 应器内进行。① 标准曲线：TAL＋ES系列（至 少三个内毒素浓度，平行二管）；② PPC ： TAL＋含中点内毒素λm的供试品稀释液（平行 二管）； ③ NPC ：TAL+供试品稀释液（平行 二管）； ④ NC：TAL+BET水（平行二管）。
供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等， 参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种 溶液至少做2个平行管。
编号 内毒素浓度
A
无
B 标准曲线的中点 (或
附近的点) 的浓度（
设为λm）
C 至少3个浓度(最低一
点设定为λ)
D
无
加入内毒素的溶液
供试品溶液 供试品溶液 检查用水
检查用水
平行管数
不少于2个
不少于2个
每一浓度不 少于2个 不少于2个
注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度）的，且
与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。 C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准
曲线的标准内毒素溶液。 D为阴性对照。
当以上初筛试验得出回收率在50%～200% 的浓度后，就以该浓度进行正式的干扰试验 操作。
其步履是：选择标准曲线中点或一个靠近 中点的内毒素浓度（以初筛试验得出回收率 在50%～200%的浓度），作为供试品干扰试 验中添加的内毒素浓度。
按表5－9制备溶液A（NPC）、B（PPC）、 C（3个浓度的标准曲线）和D（NC）。
（10）数据处理：回收率＝ES－Et／λM×100%。 在测定仪中数据处理的回收率计算机自动计出。
（11）结果判断： 标准曲线：|r|≥0.980，有效， PPC ： 回 收 率 50% ～ 200% ， 无 干 扰 ， NC的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时 间，有效， PPC：测定值在标准曲线范围内， 有效。
所有的光度测定试验都要求在特定的 仪器(如图5－13、5－14)中进行，温度 一 般 为 37±1℃ 。 供 试 品 和 鲎 试 剂 的 加 样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温 时间等，参照所用仪器和试剂的有关说 明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应 预先进行标准曲线的可靠性试验以及供 试品溶液的干扰试验。
六 光度测定法技术(选讲内客)
（一）概述 光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中 浊度变法而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度 法。终点浊度法的原理是反应混合物的内毒素 浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率) 之间存在着量化关系。动态浊度法是检测反应 混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需 要的反应时间，或是检测浊度增长速度的方法。
(4) 计算：供试品的最大有效稀释倍数MVD=L/λ 或最低有效浓度MVC=λ/L=C/MVD；
(5) 选择标准曲线的内毒素浓度范围（2～10倍 等比稀释系列，如：4λ、2λ、λ；100λ、 10λ、λ）；
(6) 确定PPC的内毒素浓度λm （标准曲线的中 点浓度）；
(7) 确定初步筛选的供试品的稀释倍数范围或浓 度范围。
显色基质法是检测鲎试剂与内毒素反 应时从选定的显色肽中释放出的有色团。
根据检测原理，分为终点显色法和动 态色法。终点显色法的基础是反应混合物 的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的 有色团的数量之间存在的量化关系。
动态显色法是检测反应混合物的颜色 到达某一项预先设定的吸光度所需要的反 应时间，或是检测颜色增长速度的方法。
5 标准曲线的可靠性试验－→ 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验－→ 7 供试品干扰试验及验证－→ 8 供试品日常的内毒素定量检查。
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百度文库
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定量法操作开机准备工作
（三）标准曲线的可靠性试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了 任何可能会影响检验结果的改变时，需进行 标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓 度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于 10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示 检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法， 每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支 阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准 曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行 线性回归分析。
标准曲线的制备程序
内毒素
→ 复溶 →
稀释为至少3个等比系列稀释液，
封口，混匀
→
稀 释 度 2~10 倍 （ 如 此 而 4λ 、 2λ 、λ或100λ、10λ、λ稀释液，
λ为最低浓度）
鲎试剂
→
复溶
内毒素测定仪： →
预热
→ →
↓
反应管，每个浓度平行3管
↓
封口，混匀
↓
插入反应器
↓
结果判断及数据处理
根据线性回归分析，标准曲线的相 关系数|r|的绝对值应大于或等于0.980， 试验方为有效。否则须重新试验。