标准曲线的可靠性试验-→6药品与鲎试剂相容性的初筛试验-→7
细菌内毒素的简介
2支供试品。
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结果判断
PC为阳性 PC为阳性 PC为阳性
NC为阴性 PPC为阳性 PPC为阳性
样品均为阴性，NC为阴性 NC为阴性
合格
样品均为阴性，样品均为阴性，
合格
合格
其他
鲎试剂灵敏度 无热原注射用 0.25EU/ml 水0.05EU/ml
供试品细菌内 为浸提介质 毒素限量不超 过0.5EU/ml
样品溶液不稀 释，当结果出 现阳性时， 1→2稀释，4 支，1支阳，
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细菌内毒素检 查用水内毒素 含量小于 0.015EU/ml
三、试验操作
▪ 1.简述 ▪ 1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察
鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效 价是否准确，也是考察检验人员操作方法是 否正确和试验条件是否符合规定。因此每个 实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进 行鲎试剂灵敏度复核项试验。 ▪ 1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检 查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确 定供试品是否存在抑制作用。
1.1细菌内毒素检查法
1885年美国的W.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学组成 和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。1956 年，美国动物学家F.Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》， 阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。1964年F.Bang和J.Levin 提出了鲎血凝集的初步机理，1968年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)方法。
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▪ 4.4 细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒 素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用细 菌内毒素检查用水的内毒素含量小于 0.005EU/ml。
鲎试验实验报告
一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。
2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。
3. 提高微生物学实验技能。
二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。
鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。
根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。
- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。
2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。
- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。
3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。
- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。
4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。
2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。
3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。
六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。
2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。
3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。
七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。
在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。
同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。
美国USP鲎试剂检测方法
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
细菌内毒素试验(鲎试验)要点及控制方法
细菌内毒素试验（鲎试验）要点及控制方法一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A 成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
银杏内酯注射液细菌内毒素检查法的探讨
银杏内酯注射液细菌内毒素检查法的探讨李婧;孙文霞【摘要】目的:建立银杏内酯注射液的细菌内毒素检查法,保证其安全性.方法:按照《中国药典》2010年版二部中细菌内毒素检查法,确定银杏内酯注射液的细菌内毒素限值,并对3批样品进行检查.结果将银杏内酯注射液稀释15倍对细菌内毒素检查无干扰作用,其细菌内毒素限值可定为1.5 EU/mg.结论:所建立的方法快速、简便、具有可行性,可用于控制银杏内酯注射液中细菌内毒素的量.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(040)005【总页数】4页(P715-718)【关键词】银杏内酯注射液;细菌内毒素检查;鲎试剂【作者】李婧;孙文霞【作者单位】西南民族大学,四川成都610041;成都大学四川抗菌素工业研究所,四川成都610051【正文语种】中文【中图分类】R927.1;R93银杏叶提取物是治疗心脑血管疾病的首选天然药物, 广泛用于治疗心脑血管疾病,是全球使用量最大的植物药, 具有卓越的疗效和安全性. 银杏内酯是银杏叶提取物最重要的有效成分. 银杏内酯注射液的主要活性成分为银杏总内酯（ginkgolide),由倍半萜内酯和二萜内酯组成, 具有很强的抗血小板活化因子活性[1-4]. 具有活血化瘀、通经活络的功效, 用于中风病中经络恢复期淤血阻络症如半身不遂, 口舌歪斜, 肢体麻木等, 适用于急性期脑梗死和恢复期脑梗死患者, 有很好的开发应用前景. 本实验按照《中国药典》[5]2010年版二部“附录XI E 细菌内毒素检查法（凝胶法)”和“附录XIX F细菌内毒素检查法应用指导原则”, 以及2005年版《中国药品检验标准操作规范》[6]中细菌内毒素检查法的要求, 对银杏内酯注射液的细菌内毒素检查法进行了考察, 为银杏内酯注射液的质量控制提供参考. 现介绍如下.1.1 试药与试剂BET用水（细菌内毒素检查用水): 批号1101040, 规格5 ml/支, 由广东湛江安度斯生物有限公司提供. CSE (细菌内毒素工作标准品): 批号为150601-201069, 规格为120 EU/支, 由中国药品生物制品检定所提供. 灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂(TAL): 批号为100101, 规格为0.1ml/支, 由湛江安度斯生物有限公司提供；批号为1101140, 规格为0.1ml/支, 由湛江博康海洋生物有限公司生产. 银杏内酯注射液: 规格10mg/2ml, 批号110801、110802、110803, 自制.1.2 仪器202-I型电热恒温干燥箱(上海产), Vortex-Genie 2/2T型旋涡振荡器(美国Scientific Industries), 19A型恒温水浴系统（德国Julabo公司). 所有玻璃器皿均在250°C下干燥2h.2.1 鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂的标示灵敏度, 用BET水将CSE稀释成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25 λ 4个浓度, 按2010年版《中国药典》依法操作. 每一浓度平行做4支, 同时用BET水做2支阴性对照, 并按式λC= antilg（∑X/4)计算λC值.根据中国药典二部的要求: 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ)时, 方可用于细菌内毒素检查. 结果CSE 浓度为2.0λ的反应管均呈阳性反应, CSE浓度为0.25 λ的反应管和阴性对照管均呈阴性反应, 可见所采用的2批灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂可用于细菌内毒素检查, 见表1.2.2 细菌内毒素限值（L)的确定本品拟临床用法为: 静脉滴注. 每次5支, 临用前加于250毫升0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中缓慢静滴, 一日1次. 依据公式L=K／M, 式中 K为5.0 EU /kg·h, 表示人每公斤体重每小时可接受的内毒素最大剂量；M 表示人用每公斤体重每小时给药的最大剂量, 本品按照50 mg银杏内酯与250ml氯化钠注射液( 限值为0.5 EU/ml) 静脉滴注1h计. (50*L+250*0.5)/60 kg·h=5 EU /kg·h, L= 3.5 EU /mg, 为了保证临床用药安全, 从严考虑, 将本品的限值定为 1.5 EU /mg.2.3 干扰初筛试验2.3.1 供试品的稀释最大有效稀释倍数MVD=cL/λ, L为1.5 EU /mg, 银杏内酯注射液的浓度c为5mg/ml. 分别计算出灵敏度为0.5, 0.25, 0.125, 0.06 EU/ml的TAL相应的MVD, 用BET水将银杏内酯注射液按照以上4个稀释倍数进行稀释, 备用.结果见表2. 2.3.2 供试品干扰初筛试验取λ为 0.5 EU/ml的TAL 16支, 其中8支分别用“2.3.1”项下的4个浓度的供试品溶液0.1 m1复溶, 再分别加入0.1 ml BET水, 每个浓度 2 支反应管, 作为供试品阴性对照反应管, 记作NPC；另外8支先分别用4个上述浓度的供试品溶液复溶, 再分别加入2λ即1.0 EU/ml的内毒素溶液0.1 ml, 每个浓度 2 支反应管, 作为供试品阳性对照反应管, 记作PPC. 结果NPC均显阴性, PPC均显阳性反应, 说明供试品在稀释15到120倍的浓度下应该对细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应无干扰作用. 结果见表3.2.4 供试品干扰确证试验选取2个不同厂家的灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂, 用BET水分别把3批供试品稀释15倍, 每一浓度平行做 4管, 同时用BET水做2支阴性对照（NC), 放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟, 观察结果, 并按Es=antilg（∑X/4),计算Es和Et. 见表4.结果Es和Et均在0.5λ～2.0λ 之间, Et/Es的值为 0.5～2.0 , 认为银杏内酯注射液在稀释15倍的浓度下对灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用.2.5 供试品细菌内毒素检查用BET水把3批银杏内酯注射液稀释15倍, 用灵敏度为 0. 5 EU/ml 的鲎试剂进行检查. 结果表明3批银杏内酯注射液的细菌内毒素检查结果均符合要求. 见表5. 银杏内酯主要包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内脂M、银杏内脂J以及白果内酯等有效成分, 这些成分具有广泛的药理活性, 如抗血管性痴呆[3], 抗血小板活化因子（PAF)作用, 因而可用于防治动脉粥样硬化, 抗心肌缺血和缺血再灌注损伤作用, 减轻老年痴呆症状等[7-11]. 银杏内酯B是钙通道和血小板活化因子的拮抗剂, 具有抗氧化作用吧, 它可以减轻脑水肿, 改善局部脑微循环, 减少脂质过氧化反应, 从而保护脑组织免受损伤[12-13]. 银杏注射液具有降低血液粘滞度, 改善微循环, 减少尿白蛋白, 保护肾功能等作用[14]. 因而银杏内酯资源的开发和应用一直是中草药研究的热点.细菌内毒素检查法是利用鲎试剂检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素, 以判断供试品中存在的细菌内毒素的限量是否符合规定的方法, 包括凝胶法和光度测定法, 具有方便、快捷、灵敏和经济等优点, 目前越来越多的品种采用细菌内毒素检查法来控制注射制剂的质量. 细菌内毒素检查必须排除外源性内毒素干扰, 所以试验所用的玻璃器皿等均应进行高温处理除去可能存在的外源性内毒素, 先用自来水将其洗干净并烘干水分, 然后用洗液浸泡4小时, 再用自来水将残余的洗液洗净, 最后用新鲜蒸馏水冲洗, 置适宜的密闭金属容器中迅速置烤箱中. 禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗, 因为纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏,会对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应.白林等人[15]对银杏内酯B注射液的细菌内毒素检查法进行了研究, 银杏内酯B注射液的临床用法用量为,成人 1 次将40 mg加到500 ml氯化钠注射液中, 静脉滴注, 在计算限量时将500 ml氯化钠注射液的内毒素限量扣除, L氯化钠为0.5 EU·m1, 笔者参考该了文献, 将银杏内酯注射液的细菌内毒素限值定为1.5 EU/mg. 干扰初筛试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验, 通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应, 初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度, 可减少干扰试验的盲目性. 实验结果Es和Et均在0.5λ～2.0λ 之间, Et/Es的值为0.5～2.0, 认为银杏内酯注射液在稀释15倍的浓度下对灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用. 银杏内酯注射液可采用细菌内毒素检查法进行检查.【相关文献】[1] 王旋, 张慧灵, 顾振纶, 等. 银杏内酯药理作用的研究进展[J]. 中草药, 2005, 36(11): 1741-1744.[2] 余新建, 刘育文, 高丽丽, 等. 银杏内酯在心血管方面的应用研究探讨[J].中国医药导报, 2008,5(9):172.[3] 叶敏, 果德安. 银杏萜内酯的研究概况. 世界科学技术-中医药现代化, 2003, 5(1): 33-38.[4] 刘彬果, 张新萍, 刘岩. 银杏叶中萜内酯类化合物的研究进展[J]. 药学实践杂志, 2011, 29(6): 421-425.[5] 国家药典委员会. 中国药典2010年版二部[S].2010. 附录99.[6] 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2005: 287-302.[7] 龚晓健, 戎志涛, 张乐多, 等. 银杏内酯的抗血管性痴呆作用[J]. 中国天然药物, 2008, 6(3): 227-231.[8] 郭瑞霞, 李骘, 李力更, 等. 天然药物化学史话: 银杏内酯[J]. 中草药, 2013, 44(6): 641-645.[9] 章红燕, 侯桂兰, 何福根. 银杏叶总黄酮和银杏内酯对心脑血管作用的研究进展[J]. 浙江临床医学, 2008, 10(4): 543-544.[10] 林悦, 武宇明. 银杏内酯中枢作用的研究进展[J]. 中国现代中药, 2009, 11(2): 11-13.[11] 韩亚荣. 银杏内酯的提取分离及药理作用研究[J]. 四川医学, 2009, 30(6): 804-806.[12] 虞靖虹, 叶志东, 李素, 等. 银杏注射液治疗儿童原发性肾病综合征的临床观察[J]. 中国实用医药杂志, 2007, 2(13): 21-23.[13] 陈蕾, 刘长金, 唐明, 等. β-淀粉肽(1-40)对海马神经元高电压激活钙电流的作用及银杏内酯B对该作用的影响[J].生理学报, 2006, 58(1):14-20.[14] 李芳君, 谢少玲, 刘永刚. 银杏内酯B对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用[J].中药材, 2011, 34(10): 1597-1600.[15] 白林, 梅世昌, 刘冰, 等. 银杏内酯B注射液细菌内毒素检查法的研究[J]. 解放军药学学报, 2006, 22(6): 452-454.。
鲎试验法检验某些抗生素原料药及其注射液等细菌...
鲎试验法检验某些抗生素原料药及其注射液等细菌...孟庆玲;杨锐【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】1992(17)6【摘要】鲎试验法(以下简称鲎法)是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应形成凝胶,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
本法具有快速、灵敏、简易、经济、实用性强等优点,因此受到世界各国科学家们的普遍重视。
目前已被世界科学较发达国家如美,英、欧洲药典所收载。
我国于1988年10月由中华人民共和国卫生部中国药典委员会颁布了《细菌内毒素检查法和鲎试剂标准(试行)》,并仅做为注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素的检查方法。
我们参考国内外资料,从1981年开始将此法应用在大输液内毒素的检验,证明该法有实用价值,并把实践中应用的体会写成了《鲎试验检测输液热原的体会》一文载于《辽宁药检通讯》杂志(1987年第一期44页)。
我们所阐述的理论及供试品的稀释公式被后来国内外文献报道所证实,是基本一致的。
然而,有大量的需要做热原检查的品种,还仍用传统的兔法(费时、费力、不经济),这些品种是否可应用快速、灵敏、经济的鲎法来检查,是科学工作者急待解决的问题。
鉴于上述情况,我们从1989年末开始把鲎法应用到抗生素,Vc等注射液的原料药,【总页数】3页(P467-469)【作者】孟庆玲;杨锐【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】TQ460.72【相关文献】1.鲎试剂检测复方柳安咖注射液中细菌内毒素的可行性研究 [J], 赵祎;张红宇;王莉;李海山2.特异性鲎试剂和非特异性鲎试剂对艾迪注射液中细菌内毒素检测的比较 [J], 施震;尹银嘉;李华3.鲎试剂法检测抗生素类药品的细菌内毒素 [J], 李敏红;汪穗福;刘效昌4.直接药敏试验法和常规药敏试验法在血液细菌检验中的应用研究 [J], 庄浩林5.鲎试剂检测10种注射用抗生素中细菌内毒素的可行性试验 [J], 刘红卫;李向荣;杜文力;王明霞;侯娟;王欣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细菌内毒素凝胶试验法
七、供试品干扰试验
（4）根据初筛试验选择：供试品有效稀释 倍数（≤MVD）或有效浓度（≥MVC）；
（5）制备：2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒 素水溶液Es系列；2λ、λ、0.5λ、0.25λ 内毒素供试品溶液Et系列；
（6）反应：TAL+BET水（NC）、TAL+供试 品溶液（NPC）各平行2管；TAL+Es系列、 TAL+Et系列各平行4管；
七、供试品干扰试验
（7）结果判断：
NC管全部阴性（- -），NPC管全部阴性(- -)； TAL+Es系列：2λ管全部阳性（+ + + +）， 0.25λ管全部阴性（- - - -）； TAL+Et系列：2λ管全部阳性（+ + + +）， 0.25λ管全部阴性（- - - -）。
六、鲎试剂灵敏度复核试验
++++
----
六、鲎试剂灵敏度复核试验
阴性 阳性
六、鲎试剂灵敏度复核试验
8、数据处理：
（1）判断依据：如果最大浓度2λ的4支管 均为阳性，最小浓度的0.25λ的4支管均为阴 性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值， 即为TAL灵敏度的的测定值（λc）。
λc＝lg-1(∑X/4) X：为反应终点浓度的对数值（lg） 当2.0λ≥λc≥0.5λ时，鲎试剂灵敏度 标示值λ有效。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒 素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度
鲎试验法实验报告
一、实验目的1. 了解鲎试验法的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用鲎试验法检测细菌内毒素。
3. 掌握细菌内毒素对生物体的危害及预防措施。
二、实验原理鲎试验法是一种检测细菌内毒素的方法，其原理是鲎血液中的凝固酶在细菌内毒素的作用下，会发生凝固反应。
通过观察鲎血液凝固的情况，可以判断样品中是否含有细菌内毒素。
三、实验材料1. 鲎血液试剂2. 细菌内毒素标准品3. 待测样品4. 实验器材：移液器、试管、恒温水浴锅、计时器等四、实验步骤1. 准备工作（1）将鲎血液试剂置于37℃恒温水浴锅中预热10分钟。
（2）取试管若干，标记为A、B、C、D，分别加入鲎血液试剂。
2. 标准曲线绘制（1）取标准品，按照说明书要求，用生理盐水进行稀释，得到一系列浓度梯度的标准品溶液。
（2）取试管A，加入鲎血液试剂1ml，再加入标准品溶液0.1ml，混匀。
（3）按照相同方法，分别向试管B、C、D中加入不同浓度的标准品溶液，混匀。
（4）将试管置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。
（5）观察各试管凝固情况，记录凝固时间。
3. 待测样品检测（1）取试管E，加入鲎血液试剂1ml，再加入待测样品0.1ml，混匀。
（2）将试管E置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。
（3）观察试管E凝固情况，记录凝固时间。
4. 结果分析（1）以标准品浓度为横坐标，凝固时间为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得对应的细菌内毒素浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：通过绘制标准曲线，可以得到标准品浓度与凝固时间之间的关系，为待测样品的检测提供依据。
2. 待测样品检测：根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得细菌内毒素浓度为5EU/ml。
六、实验结论本实验采用鲎试验法成功检测出待测样品中的细菌内毒素，浓度为5EU/ml。
结果表明，鲎试验法是一种简单、快速、灵敏的细菌内毒素检测方法，适用于临床和科研领域。
七、实验讨论1. 鲎试验法具有操作简便、快速、灵敏等优点，是一种理想的细菌内毒素检测方法。
G试验检测及鲎试验检测
虽然试剂成本相对较低，但仪器成本 较高，且需要特殊的操作技能。因此， 整体检测成本也较高。
05
结论
G试验和鲎试验在临床应用中的重要性
01
诊断感染性疾病
G试验和鲎试验均可用于诊断感染性疾病，特别是对于血液感染和深部
组织感染。通过检测细菌内毒素或葡聚糖，这两种试验有助于快速识别
病原体，指导临床医生选择合适的抗菌药物。
02
监测治疗效果
在治疗过程中，G试验和鲎试验可用来监测治疗效果。如果感染得到控
制，内毒素或葡聚糖的浓度通常会下降，这表明治疗有效。如果浓度持
续升高或居高不下，可能需要调整治疗方案。
03
评估患者预后
通过定期进行G试验和鲎试验检测，可以评估患者的预后。较低的内毒
素或葡聚糖浓度通常意味着病情好转，而持续高浓度可能表明疾病恶化
G试验检测方法
01
02
03
04
样品处理
将待测样品进行处理，使葡聚 糖与鲎细胞反应底物充分接触
。
鲎细胞培养
将鲎细胞与处理后的样品进行 混合培养。
检测
通过特定的检测方法，如酶联 免疫法或荧光法，测定培养液
中葡聚糖的含量。
结果判定
根据测得的葡聚糖含量，判断 是否存在内毒素污染。
G试验检测的优缺点
优点
G试验具有较高的灵敏度和特异性，能够快速准确地检测内 毒素污染，尤其适用于临床诊断和药品生产过程中的质量控 制。
鲎试验检测的原理基于鲎血液中特殊的凝固酶反应，当鲎血液与内毒素接触时，凝固酶被激活并释放 出一种特殊的蛋白质，该蛋白质可以与内毒素结合并使其失去活性。通过观察鲎血液的凝固情况，可 以判断样品中是否存在内毒素。
鲎试验检测方法
鲎试剂灵敏度
▪ 鲎的血变形细胞中含有两种物质，即高相对分子质量的凝固 酶原和凝固蛋白原，凝固酶原被内毒素激活转化成具有活性 的凝固酶，在凝固酶的酶解作用下，将凝固蛋白原转化成凝 固蛋白，凝固蛋白又通过交联酶作用互相聚合而形成牢固的 凝胶。可简单表示如下： 内毒素
↓ 凝固酶原-----→凝固酶
↓ 凝固蛋白质-----→凝固蛋白
死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗 生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，
如多粘菌素、杆菌肽等。
（5）细菌素
某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗 菌范围很窄，无治疗意义，但可用于细菌分型和流 行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠埃希菌 产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓 菌素，霍乱弧菌产生的称霍乱菌素。
交联酶↓ 凝胶
三、操作用仪器及试剂
1．仪器 超净工作台，分析天平（万分之一） ， 细菌
内毒素定量测定仪 ，电热干燥箱， 旋涡混合器， 三角瓶， 凝集管（10mm×75mm）， 小试管 （16mm×100mm）， 移液管（或刻度吸管、 定量移液器）, 大口径试管，水浴恒温器或干热 恒温器， 试管架， 计时器, 洗耳球, 封口膜 或金属试管帽 , 脱脂棉，吸水纸，剪刀，砂轮等。
第二节 微生物内毒素测定的操作
可作为部分注射剂热原检查的代替方法，与
一、操作目的 家兔热原检查法相比，有快速、灵敏、重现
性好、简便易行等优点，并有利于热原检查 标准化。
二、操作原理
鲎,属节肢动物，肢口纲。在3亿中前的泥盆纪末期，鲎就问世 了，堪称海洋里的远古遗民。鲎是用鳃呼吸的节肢动物,目前 世界上仅有4种：中国鲎、美洲鲎、马来鲎和圆尾鲎。
通常利用生化试验的方法，检测微生物对 各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为微 生物的生化反应。这一反应通常用于微生物 的鉴别。
《中国药典》2015年版BET法—2016.6
结果判断方法
• 2010年版：将溶液A中的两个平行管反 应终点浓度的几何平均值与限值进行比 较，几何平均值大于限值则判定为不符 合规定。
• 2015年版： 将溶液A中的两个平行管反
应终点浓度分别与限值比较，当两个平 行结果中有任何大于限值时判定为不符
合规定。
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结果判断方法
主要区别
供试品 结果
8
项目
动态显色 法定义
2010年
2015年
动态显色法是检测反 动态显色法是检测反应混 应混合物的色度达到 合物的吸光度或透光率达 某一预先设定的吸光 到某一预先设定的检测值 度所需要的反应时间， 所需要的反应时间，或检 或检测色度增长速度 测值增加速度的方法。 的方法。
光度法结 果判断
当阴性对照的反应时 间大于标准曲线最低 浓度的反应时间
式CE=antilg（∑X/2）〕。 若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试 品不符合规定。
20
结果判断方法
2015年版
系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ，为每 个系列的反应终点浓度，如果检验的是稀释过的供试 品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始 稀释倍数，即得到每一系列的内毒素浓度C。 若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试 品符合规定。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为 供试品溶液的内毒素浓度〔按公式CE=antilg （∑C/2）〕。 若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值，则判定 供试品不符合规定。
SE¼λ － － － －
2010年： Es=2λ; ½Es=λ, 2Es=4λ; Et=½λ，存 在干扰作用！
2015年： λB=½λ，无 干扰作用！但 实际可能存在 增强干扰作用。
标准品、鲎试剂操作规程
标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。
1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。
2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.责任：QC人员。
4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。
到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。
4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。
交化验室主任核准后，交物料部采购。
4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。
4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。
4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。
无误后，方可接收。
4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。
4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。
4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。
4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。
4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。
4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。
4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。
4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
显色法鲎试剂
显色法鲎试剂下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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鲎试剂灵敏度稳定性的考察
鲎试剂灵敏度稳定性的考察
陈引秀
【期刊名称】《海峡药学》
【年(卷),期】2004(16)3
【摘要】目的考察鲎试剂灵敏度的稳定性.方法将鲎试剂存放在室温、10℃以下的冰箱内,在不同时间内按鲎试剂灵敏度测定的方法测定其灵敏度.结果经考察在不同条件下,不同时间内,鲎试剂的灵敏度变化不大.结论鲎试剂的灵敏度在符合标准规定的前提下,是稳定的,建议可适当延长其有效期.
【总页数】2页(P83-84)
【作者】陈引秀
【作者单位】福建省药品检验所,福州,350001
【正文语种】中文
【中图分类】R927.12;R927.11
【相关文献】
1.温度对鲎试剂灵敏度影响的实验观察 [J], 徐进春;黄武光
2.鲎试剂的灵敏度复核 [J], 邵民象;于秉新
3.鲎试剂灵敏度稳定性观察 [J], 金华
4.鲎试剂灵敏度对玻璃注射器细菌内毒素检测的影响 [J], 吕月球;张伟英;赵水花;马备娟;何风芝
5.东方鲎人工饲养抽血制备鲎试剂的实验考察 [J], 刘端华;林嘉富;郑丽莉;王立克;柯春生
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细菌内毒素检查技术培训班 讲 义
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4. 细菌内毒素检查实验的恒温反应在37℃
的恒温器中进行。
TAL-40型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用 于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有
A, 温度稳定； B, 加热均匀； C, 定时报警等特点
2007-9-10
Bitab
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三、凝胶法细菌内毒素检查技术
1，凝胶法BET试验程序 2，试验器具 3，鲎试剂灵敏度复核 4，干扰初筛试验 5，干扰试验 6，检查法
-- 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布
2007-9-10
Bitab
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2、鲎试剂
1）鲎试剂的分类
-- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）
-- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂
-- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂
2007-9-10
① B、C阳性 ② D阴性
① | |≥0.980 ② 50%≤R≤200% ③TD＞TC
2007-9-10
Bitab
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6、相关参数的计算
1）内毒素限值
（1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式 确定：L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示； K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kg·h)表 示，注射剂K=5 EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2 EU/(kg·h),鞘内 用注射剂K=0.2 EU/(kg·h), M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、 mg/(kg·h)、 U/(kg·h)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂若 不足1小时，按1小时计算。
内毒素光度测定法检查技术
动态曲线
0
孕育期
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反应期
结束
T（分）
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动态曲线的特点
• 把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（ C1>C2>C3 ），分别 与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：
Rt（%）
C1
分析动态曲线可看出：
1. 内毒素浓度越高，孕育期越短；
是否满足BET试验要求
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1、试剂
试剂名称
厂家
动态浊度法TAL
安度斯
内毒素标准品（CSE） 安度斯
BET水（W）
安度斯
装量
规格
1.25ml/支 10EU/ml~0.03EU/ml
10ng/支 10EU/ng（CoA）
25ml/瓶 内毒素<0.003EU/ml
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试验步骤
• 1、供试品限值的确定 • 2、试剂的选择 • 3、供试品最大有效稀释的计算 • 4、反应溶液的制备 • 5、加样及反应 • 6、结果判断
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干扰初筛试验举例
• 供试品限值
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2、光度测定法原理
• 光电转换原理
– 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光 度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。
– 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我 们称I为透光强度。
透光容器
– 已经取得医疗器械许可证
仪器特点：
1、体积小巧，占用空间小；
– 完善的售后服务
试验检测及鲎试验检测ppt课件
1377
真菌
2370
8 肝胆管
1277
结核
1259
9 围产期
1305
胃肠道
1053
10 真菌
828
围产期
820
真菌感染的死亡率上升了3.4倍
（死亡率：0.7~2.4 /100,000）
•实体肿瘤
3
•人们称它为“活化石”。
•鲎试验反应机理
•若当日不能及时检测的标本应将离心后的血浆转移至无β葡聚糖的容器内20℃以下冷冻保存，一周内使用。
【假阳性因素】
（13）βD葡聚糖污染。使用非试剂厂家提供的 采血管、反应试管、吸头等容易受（13）βD葡 聚糖污染；
某些纤维素透析膜污染，如血液透析、腹膜透析 等；
G试验前注射过香菇多糖、脂肪乳,双黄连,生脉 ，黄芪 注射液等药物。白蛋白等血制品
纱布，或其它医疗物品（外科手术）
连续检测有助于降低假阳性的发生，葡聚糖的测 定值在连续监测中出现快速较大幅度的变化提示 假阳性，尤其是对还未开始抗真菌治疗的患者
•G试验采样及结果分析参考
•（13）βD葡聚糖污染。
•存在宿主因素建议抢先用药治疗。
•三 鲎试验检测—革兰氏阴性菌感染检测
Hale Waihona Puke •全身性细菌感染全身性细菌感染主要见于败血症。
侵袭性真菌病已变得越来越常见
美国西弗吉尼亚大学医院深部真菌感染 危险因素评分
临床危险因素
广谱抗生素应用≥4天 胃肠道手术 中心静脉置管 驻留ICU ≥4天 应用抗生素=4天，体温仍>38℃ 血液系统恶性肿瘤 实体肿瘤 糖尿病 留置尿管 机械通气>48h 完全肠外营养（TPN） 粒细胞减少（<1000/mm3） 低血压 创伤 反复收住ICU 外周静脉置管
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编号 内毒素浓度
A
无
B 标准曲线的中点 (或
附近的点) 的浓度（
设为λm）
C 至少3个浓度(最低一
点设定为λ)
D
无
加入内毒素的溶液
供试品溶液 供试品溶液 检查用水
检查用水
平行管数
不少于2个
不少于2个
试验 通常在干扰试验进行之前先做药品与鲎试 剂相容性的初筛试验[目的：确定供试品无干扰 的稀释倍数范围（或浓度范围）]。其初筛试验 程序是：
(1) 记录: ①供试品名称、浓度C（或干粉重量及 溶解后浓度C）； ②最大人体剂量M (查阅中国 药典、USP、EP或有关研究药品鲎试验的文献)
(2) 计 算 供 试 品 的 内 毒 素 限 值 L=K/M 。 (3) 选择试剂：①TAL或LAL（抗干扰能力、缓 冲能力、灵敏度、阴性控制、溶解性等）； ② BET 水 （ 内 毒 素 含 量 小 于 0.005Eu/ml ） ； ③ RSE或CSE（经RSE标化）；
显色基质法是检测鲎试剂与内毒素反 应时从选定的显色肽中释放出的有色团。
根据检测原理，分为终点显色法和动 态色法。终点显色法的基础是反应混合物 的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的 有色团的数量之间存在的量化关系。
动态显色法是检测反应混合物的颜色 到达某一项预先设定的吸光度所需要的反 应时间，或是检测颜色增长速度的方法。
（10）数据处理：回收率＝ES－Et／λM×100%。 在测定仪中数据处理的回收率计算机自动计出。
（11）结果判断： 标准曲线：|r|≥0.980，有效， PPC ： 回 收 率 50% ～ 200% ， 无 干 扰 ， NC的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时 间，有效， PPC：测定值在标准曲线范围内， 有效。
当以上初筛试验得出回收率在50%～200% 的浓度后，就以该浓度进行正式的干扰试验 操作。
其步履是：选择标准曲线中点或一个靠近 中点的内毒素浓度（以初筛试验得出回收率 在50%～200%的浓度），作为供试品干扰试 验中添加的内毒素浓度。
按表5－9制备溶液A（NPC）、B（PPC）、 C（3个浓度的标准曲线）和D（NC）。
5 标准曲线的可靠性试验－→ 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验－→ 7 供试品干扰试验及验证－→ 8 供试品日常的内毒素定量检查。
→
→
→
→
→
定量法操作开机准备工作
（三）标准曲线的可靠性试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了 任何可能会影响检验结果的改变时，需进行 标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓 度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于 10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示 检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法， 每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支 阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准 曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行 线性回归分析。
英国Lab Kinetics 公司
ATi-320动态试管仪, 32孔，可变波长
BET － 72 型 细 菌 内 毒 素 检查法（定量法用）测定 仪（天大天发科技有限公 司研制 )
（二）光度测定法的实验程序 1 试剂仪器用具等的试验准备－→ 2 研定药品细菌内毒素的限值（L）－→ 3 选择定量鲎试剂－→ 4 计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最 低有效浓度（MVC）－→
六 光度测定法技术(选讲内客)
（一）概述 光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中 浊度变法而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度 法。终点浊度法的原理是反应混合物的内毒素 浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率) 之间存在着量化关系。动态浊度法是检测反应 混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需 要的反应时间，或是检测浊度增长速度的方法。
所有的光度测定试验都要求在特定的 仪器(如图5－13、5－14)中进行，温度 一 般 为 37±1℃ 。 供 试 品 和 鲎 试 剂 的 加 样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温 时间等，参照所用仪器和试剂的有关说 明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应 预先进行标准曲线的可靠性试验以及供 试品溶液的干扰试验。
(8) 制备： ① 标准内毒素系列（用BET水稀 释的内毒素标准溶液）；② NPC稀释系列 （不含内毒素的供试品稀释系列）；③ PPC稀 释系列(含标准曲线中点浓度内毒素λm的供试 品稀释系列)
(9) 反应： 在ATi系统或BET－72型测定仪的反 应器内进行。① 标准曲线：TAL＋ES系列（至 少三个内毒素浓度，平行二管）；② PPC ： TAL＋含中点内毒素λm的供试品稀释液（平行 二管）； ③ NPC ：TAL+供试品稀释液（平行 二管）； ④ NC：TAL+BET水（平行二管）。
标准曲线的制备程序
内毒素
→ 复溶 →
稀释为至少3个等比系列稀释液，
封口，混匀
→
稀 释 度 2~10 倍 （ 如 此 而 4λ 、 2λ 、λ或100λ、10λ、λ稀释液，
λ为最低浓度）
鲎试剂
→
复溶
内毒素测定仪： →
预热
→ →
↓
反应管，每个浓度平行3管
↓
封口，混匀
↓
插入反应器
↓
结果判断及数据பைடு நூலகம்理
根据线性回归分析，标准曲线的相 关系数|r|的绝对值应大于或等于0.980， 试验方为有效。否则须重新试验。
(4) 计算：供试品的最大有效稀释倍数MVD=L/λ 或最低有效浓度MVC=λ/L=C/MVD；
(5) 选择标准曲线的内毒素浓度范围（2～10倍 等比稀释系列，如：4λ、2λ、λ；100λ、 10λ、λ）；
(6) 确定PPC的内毒素浓度λm （标准曲线的中 点浓度）；
(7) 确定初步筛选的供试品的稀释倍数范围或浓 度范围。
每一浓度不 少于2个 不少于2个
注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度）的，且
与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。 C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准
曲线的标准内毒素溶液。 D为阴性对照。