简述全内反射荧光显微术原理与应用

简述全内反射荧光显微术原理与应用

柳正(10589537)

北京大学医学部基础医学院生物物理系

【摘要】全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。近年来，全内反射荧光显微术被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。文章综述全内反射荧光显微技术的基本知识，介绍几个运用全内反射荧光显微镜技术研究生物单分子的实例。

【关键词】:全内反射荧光显微镜消逝波单分子蛋白相互作用构像变化

1引言

从单分子水平上对生物分子行为（包括构象变化、相互识别、等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵等，研究者籍此可以深入理解生物活动的机制与产生生物分子效应过程。生物单分子成像技术在生物系统研究中已经广泛使用。随着生物单分子研究深入，越来越要求发展超高分辨率的成像与高信噪比成像技术。近些年来，发展前景被看好的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领域受到广泛关注。其中，全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波来照射样品，从而致使在样品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的荧光团受到激发，使单分子成像。

全内反射荧光显微术发展历程，Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新的突破。虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。至今该项技术已经应用到许多单分子的研究中，如肌球蛋白酶活性测量[2]，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究[3]。另外蛋白的构像的动态变化[4][5]，人工膜中膜蛋白的研究等[6][7]。

2. 全内反射的基本原理

全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式

n1sini=n2sinr (1)

图1

图2

若n1大于n2，例如折射率为n1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射，如图2所示。由Snell定律可知θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) (2)

由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。

从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度ｚ减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为消逝场(evanescent field)。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[8]。消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光消逝波。消逝波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。透射强度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。

(3)

3. 全内反射的仪器组成[9]

到目前，研究者已经发展了多种全内反射荧光显微成像系统。其中最为普遍的两种类型是棱镜型图3所示和物镜型图4所示。棱镜型成像系统的消逝失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。消逝波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的荧光经过物镜成像到照相机或CCD上实现对生物样品的记录。

图3棱镜型全内反射荧光显微镜示意图

图4 物镜型全内反射荧光显微镜示意图

两种形式的显微镜各有优缺点，对于棱镜型而言，实现起来相对简单，同时它的缺点也很明显：由于要达到较高的光学分辨率，要求接收荧光的物镜工作距离较短，这样留给生物样品和物镜之间的空间较小，所以在此仪器上安装一些诸如原子力显微镜、近场光学显微镜等其他探测仪器非常困难。物镜式显微镜的物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。如图4所示，激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现消逝波照明。消逝激发的荧光仍旧经过物镜接收，通过双色镜滤掉除荧光以外的其它波长的光，成像在物镜后方的照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光记录。由于样品上方空间完全空出，并且所接受的荧光没有被样品干扰，所以目前大多数生物学家采用物镜式全内反射荧光显微镜[10]

4在生物研究中的应用

细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微

术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术[11]。

4.1蛋白分子相互作用

通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。伴侣蛋白利用ATP的水解释放的能量协助蛋白质分子的折叠。分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。分别用不同的荧光标记GroEL与相关蛋白，然后观察它们的协同定位。单分子观察发现通过GroEL协助蛋白折叠动态过程[12]。

单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。只有在供体和受体的荧光团非常接近时候，(距离小于10nm)荧光共振才能够发生。Ishii 等人于1999年测定了用蓝环素3，蓝环素5标记的a原肌球蛋白亚基的连接的荧光共振能量转移。当肌球蛋白亚基形成同型二聚体的时候，它们之间的距离非常的近，非常适宜荧光共振与转移[13]。在核酶分子构像变化观察中，也运用到这种方法[14]。

4.2生物大分子动态构像变化观察

单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。Suzuki 等于2002年，运用棱镜型全内反射荧光显微术发现另外一种肌球蛋白构型。他们在荧光光学系统中设计了一种特殊的楔形棱镜，从而可以在成像相机设备上获得单个荧光分子光谱像[15]。

4.3离子通道研究

离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。虽然现在离子通道的状态变化与其功能的关系还有待研究，但是Ide和其同事发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流[16]。

全内反射荧光显微术作为细胞表面单分子成像的一种新兴的技术，研究者在已经的基础上做出了一些改进，一是与其它显微成像技术如荧光相关光谱技术(FCS),荧光寿命成像技术(FLIM)以及原子力显微术(AFM)相结合;另一方面是发展双色和多色TIRFM，采用多种染色来观察活体细胞[17]。另外还有一些的数学方法如统计分析加入到这个对单分子的记录中来。随着仪器设备的改进，与样品制备的技术的提高，全内反射显微镜发挥它的用处将越来越大。

5参考文献：

[1] Shuming Nie, Richard N. Zare.( 1997) Annu Rev Biophys Biomol Struct, 567:596.

[2]. Funatsu T,Harada Y, Tokunaga M, Saito K,Yanagida T (1995) Nature 374:555

[3]. Tokunaga M, Kitamura K, Saito K, Iwane AH,Yanagida T (1997) Biochem Biophys Res