几种生物新技术的研究进展

三种生物新技术在微生物研究中的应用进展
摘要：本文对几种时下比较热门的生物技术的应用原理、存在的问题和研究进展进行了简单阐述，并且结合自己研究的领域，浅析了这些新兴的生物技术在生物防治真菌中研究的实际应用。

关键词：微生物新技术；基因编辑技术；RNA 干扰技术；DNA 芯片技术
一、基因组编辑新技术：CRISPR–Cas
近年来，随着生物技术突破性的变革及科学家们不断的努力，新的基因编辑技术不断涌现出来，出现了当下最热门最新型的CRISPR/Cas9 基因编辑系统。

近日，中国科学家利用该基因编辑技术对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。

科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA 片段的敲除、加入等。

而CRISPR/Cas9 技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

1. CRISPR/Cas9 基因编辑技术概述
CRISPR/Cas9 基因编辑技术是最近几年出现的一种由RNA 指导Cas 核酸酶对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术。

它是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。

此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链DNA ，从而实现对基因组DNA 序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。

作为一种RNA导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，它能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。

将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null) 融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何dsDNA 序列，而RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响Cas9 的结合。

因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

2. CRISPR/Cas系统的灵感来源
CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。

与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌CRISPR/Cas系统实现的。

在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（成簇的规律间隔的短回文重复序列）。

首先，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。

病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。

“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（原间隔序列临近基序），当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。

这就是“间隔序列”产生的过程。

然后，当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。

同时，在CRISPR 序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。

CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA 和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA
的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。

这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。

正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。

3. CRISPR/Cas9存在的问题
Cas9 酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是CRISPR 技术需要克服的重大技术问题。

在任何临床应用之前，医生和监管机构必须确保Cas9 酶不会引起非目标基因组的损伤。

11月30日，发表在《科学》杂志上的一项研究中，麻省理工学院-哈佛医学院Broad 研究所的研究小组又取得了一项突破性的成果。

研究人员通过创建了3个新版本的Cas9 酶大大降低了CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应；有效改善了这一技术的最大局限性之一。

在这项研究中，科学家们利用了Cas9 蛋白的结构知识来降低脱靶切割（off-target cutting），即带负电荷的DNA 是结合到带正电荷的Cas9蛋白的凹槽。

基于这样的原理，他们预测，相较于“靶向”序列，用一些中性氨基酸来替代正电荷的氨基酸，可以减少Cas9 与“脱靶”序列的结合。

在试验了各种可能的改变后，张锋研究小组发现三个氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。

利用测试的导向RNAs，研究人员证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。

研究小组将这种新设计的酶命名为“增强型”化脓性链球菌，可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。

4. CRISPR/Cas9 的应用前景
CRISPR/Cas9 技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用，不断取得喜人的新成果。

如在医疗健康领域，用iPS 细胞（诱导多能干细胞）治疗人类的镰刀形贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成iPS 细胞，利用该技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS 细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。

此外，像使用CRISPR 技术根除HIV 病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature 等著名杂志所报道。

在奶制品的发酵中，利用CRISPR/Cas9 增强发酵菌株对噬菌体的防御能力；在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显着影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等。

但正如科学是把双刃剑，任何新技术的出现都少不了其反对者的存在，在该技术得到热烈呼声的同时，不少人也对它提出了质疑，特别是对其脱靶事件可能导致基因组其他位置产生未知突变表示担忧。

作为生命科学领域的一项重大突破，CRISPR/Cas9 的创新性、技术性毋庸置疑，随着对CRISPR 系统认识的加深，实验设计的优化改造，相信其打靶效率会进一步提高，CRISPR/Cas9 以及其衍生技术终究会带来一场科学史上的巨大变革。

期待在不久的将来其所带来的巨大转变必将能够惠泽万家，到时候属于它的诺奖终将到来。

二、RNA 干扰技术
1.RNA干扰技术概述
RNA 干扰(RNA interference , RNAi) 是由双链RNA ( double -stranded RNA, dsRNA) 所引起的序列特异性基因沉默，是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制(cosuppression)、转座子沉默(transpo son silencing) 以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。

RNA干扰依赖于小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA) 与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA 为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。

RNA 干扰技术为人们迅速、准确的剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路。

作为一种进化上高度保守的抵御外源基因或外来病毒侵犯的防御机制RNAi 广泛存在于各种生物体内，同时在生物生长发育中扮演着基因表达调控的角色，使人们重新认识了RNA 在生命活
动过程中的重要性。

2 RNAi 发生的机制
基因分析和生化研究证实RNAi 共抑制及病毒诱导的基因沉默有着相似的作用机制。

它们通过dsRNA 引起的靶mRNA 降解，阻抑翻译同源基因DNA 甲基化或染色质结构修饰来发挥其调节作用通过对RNAi 现象的遗传学与生物化学研究，其作用机制已日渐清晰。

2.1 靶mRNA 的降解
导入生物体的dsRNA 在ATP 供能下被Dicer 复合物切割，生成约22 个核苷酸的小干扰RNA small interfering RNA siRNA Dicer 是一种蛋白复合物,含有RNA 依赖的RNA 聚合酶，和一个具有解链酶及激酶活性的核酸内切酶，RdRP 不但能识别内外源性异常单链RNA 将其转变为dsRNA 后诱导RNAi 的发生，而且在siRNA 的信号扩增中起重要作用。

Dicer 中的核酸酶属于核糖核酸酶ⅢRNaseⅢ家族，它切割较长的dsRNA 使其降解为多个22 nt 的能引起特异性RNAi 的小双链RNA片段，即siRNA 加工后的siRNA 在其两条链的3＇端均含有2 个未配对的核苷酸，且5＇端磷酸化siRNA 随即与约360kD 的蛋白结合形成无活性的RNA 诱导的沉默复合物(RNA－induced silencingcomplex RISC) ，其中包括一个解旋酶和一个核酸内切酶Slicer 在ATP 供能下RISC 中的解旋酶将siRNA 双链解开转变为活化的形式RISC 反义siRNA 介导该活化复合物识别并结合至靶mRNA 最终，Slicer 在无须ATP 参与下切割靶mRNA 发挥作用Dicer 和Slicer 相继在RNAi 通路中发挥作用被认为是靶mRNA 降解的主要路径。

2.2 翻译水平的调节
细胞内70 nt 的茎－环结构或双链RNA 前体转录物被Dicer - Argonaute 复合物特异性识别后，降解成22 nt 5＇端为单磷酸基3＇端为羟基的单链小RNA 分子，与相关蛋白结合成另一种RISC 复合体可识别并结合靶序列的3′端非翻译区UTR 抑制其翻译过程从而调控基因表达。

目前在果蝇、线虫和哺乳类动物中发现了100 多种内源性22 nt 的miRNA ，它们中的很多功能仍不清楚，推测其在翻译水平调节基因的表达，研究较多的是线虫中的22 nt 的lin-4 和let-7 的RNA 可通过抑制特异mRNA 翻译导致其编码蛋白表达受抑，调控幼虫不同发育阶段间的移行，称为小时序(RNA small temporal RNA stRNA) 是miRNA 的一部分。

lin-4和let-7的一个显著特点是它们不能与其靶mRNA 形成完全的碱基配对，而是包含凸出的未匹配核苷酸和G 、U 错配碱基，可能的解释是，在前一种mRNA 水平调节机制中siRNA 与其靶mRNA 的完全序列互补导致该mRNA 的酶切降解，而后一种翻译水平调节则是由于碱基配对不完全，不发生靶mRNA 的切割RISC 不再具有酶切活性，而获得了翻译抑制因子的作用，使核糖体延伸受阻，翻译过程即受到抑制。

线虫中内源性的RNAi 诱导子lin-4、let-7 在蛋白合成水平发挥作用，虽然dsRNA 在翻译水平调控基因表达在其他生物系统中并不确定，但let-7 及其相关RNA 在生物间高度保守的事实提示这种调控模型可能是RNAi 控制细胞基因表达的更为广泛的机制。

2.3 基因组甲基化修饰及结构改变
dsRNA 诱导的RNAi 除了在转录后水平发挥作用外，还可通过其他机制影响基因表达。

植物中的dsRNA 可以使与沉默触发子即siRNA 同源的基因组位点甲基化，引起遗传学特性的改变。

推测通过募集组蛋白乙酰化酶抑制转录来调控生命活动，这种甲基化不对称且不局限于CpG 或CpXpG 序列，如果甲基化发生在编码链，虽然基因沉默仍可在转录后水平发生，即PTGS 但该基因位点的转录并不受明显影响，如该触发子与其靶基因启动子序列互补，该基因即可发生转录水平沉默transcrip-tional gene silencing TGS 与PTGS 的一过性特征不同，TGS 很稳定并且能够遗传至下一代。

研究表明，在植物、果蝇、线虫和真菌中，RNAi 可通过改变染色体结构影响基因表达[7]。

任何使转甲基酶MET1 或染色体改建复合物DDM1 发生改变的因素均可影响拟南芥中沉默的程度及其维持，在这些机制中RISC 是一个
很灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能RISC 复合物的核心负责接受从Dicer 加工来的小RNA ，并用该小RNA 作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi 的发生。

根据沉默信号的不同，如沉默触发子不同的结构和位置不同功能的效应分子可结合至RISC 的核心结构，siRNA 引起靶mRNA 降解时，核酸酶结合至RISC 使其获得了内切酶的特性，在miRNA 介导的蛋白调节作用中，翻译抑制因子参与了RISC 的形成。

RISC 则能阻止翻译的进程，转录水平沉默则可能由于染色体结构改建因子或甲基化酶的参与使RISC 有了修饰及改变染色体结构的功能，有很多其他分子也可能参与其中并发挥调节作用。

3 RNAi技术的应用
虽然对RNAi 的研究只有短短几年时间，但RNAi 技术已经快速被应用于多个领域。

3.1 基因功能研究
随着人类基因组计划的提前完成，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。

而RNAi 技术已成为解决这些问题的重要手段。

与其他方法相比，RNAi 技术在基因功能研究上有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除相比实验周期短，成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量基因功能分析。

RNAi 技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法。

3.2 基因敲除
虽然传统的基因敲除技术被广泛用于一些功能基因的研究，但在实际应用中存在一些不容忽视的问题。

它不利于在短期内研究数量较多的基因传统的基因敲除无法满足研究的需要，因为胚胎可能在早期就因为缺失此基因而死亡；在某些制造基因敲除动物模型十分困难或因伦理学原因根本不可能进行。

3.3 研究信号传导通路的新途径
联合利用传统的缺失突变技术和RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系。

Clemensy 等用RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果。

RNAi 技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好、克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点因此可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。

3.4 基因治疗
目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争，这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi 高效、特异、持久、作为基因治疗的工具，RNAi 既高效特异，又简便易行。

RNAi 在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染、肿瘤等。

在后基因组时代RANi 的出现为我们的生命科学研究提供了一个崭新的、高效的工具。

尽管RANi 目前仍存在一些无法克服的问题，但随着研究的不断深入，一些问题将不断得到解决，预示着一个崭新的RNA 时代即将来临。

三、DNA 芯片技术
DNA 芯片技术作为一种高通量的核酸分析方法，已经成为“后基因组时代”中研究海量序列信息的重要分析工具之一。

本文简述了目前一些常用以及和新出现的DNA 芯片的技术原理，并从微生物基因表达谱研究、微生物基因组学研究以及微生物检测鉴定研究等多个方面概述了DNA 芯片技术在微生物学中的应用，同时在对DNA 芯片技术的不足进行简要分析的基础上，展望了其进一步应用的前景。

1 DNA芯片技术概述
所谓DNA芯片就是将研究者所感兴趣的众多DNA分子作为探针，按照一定的排列方式，同时固定到特定的介质上，也有研究人员称之为微点阵。

从大的方面分类，目前经常使用的
DNA芯片有以下几种。

1.1 点样式微点阵芯片
这类芯片是目前使用最为广泛的DNA 芯片，所使用的探针包括PCR 产物、cDNA 以及人工合成寡核苷酸等，这些探针都需要预先制备好后，使用特定的手段固定在特定的介质上，最常用的介质包括玻片和膜。

早期的cDNA 阵列是制备在尼龙膜或硝酸纤维素膜上的，1995 年有科学家等率先使用玻片作为芯片的介质，制成DNA 微阵列玻片。

玻片与膜相比具有许多优点，例如韧性好，可以耐受高温和高离子强度漂洗，玻片荧光本底低，不会造成很高的本底“噪音”等等。

1.2 原位光导合成寡核苷酸阵列芯片
这是由Affymetrix 公司根据一种全新的技术理念，于1993 年推出的一种DNA 芯片。

这种芯片的表面包被了一层加有光敏保护基团的连接分子，可以利用DNA 固相合成原理加上一个同样带有光敏保护基团的核苷酸；每次所加核苷酸的种类及其在玻片上的位置可以通过计算机程序预先设定；反复进行上述合成步骤最终可以得到所需的寡核苷酸阵列。

原位光导合成法芯片的最大特点是可以在很小的面积上合成大量已知序列的寡核苷酸。

1.3 DNA三维衬垫阵列芯片
前两种芯片的点样介质均为玻片，最近有一些研究人员利用凝胶条、光学纤维、微球等材料构建三维衬垫阵列，可达到快速高效进行检测分析的目的。

例如凝胶衬垫条的三维结构提供了一个稳定的支持作用，能够结合更多的DNA 探针，可以显著增强检测的灵敏度。

而Brenner 等将cDNA 子分别连接每个微球上，将微球固定在芯片表面，将芯片置于一个具流动相的小槽内，以cDNA 克隆为模板，按大规模平行标记测序原理，可以不进行DNA 片段分离步骤直接对cDNA 克隆进行测序。

2 微生物学研究中的DNA 芯片技术
2.1 基因表达谱研究
就DNA 芯片而言，基因表达谱研究是目前研究最多、应用最为成熟的领域。

由于在芯片上可以固定成千上万的探针，这使得众多基因的同时检测成为可能。

我们可以对比在不同条件一个基因组中大量基因的转录水平差异，也可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差异；这一特点从根本上突破了以前基因研究中一次只能关注一个或几个基因的瓶颈，极大地推动了微生物学相关研究的进展。

2.2 微生物基因组学研究
随着越来越多的细菌基因组序列的公布，比较基因组学究逐渐成为微生物研究的热点。

比较基因组学研究可以提非常丰富的信息，指导后续的功能基因验证等工作。

例如，比较同一个致病菌致病力不同菌株的基因组序列，可以推断出一些与致病力密切相关的基因；比较极端环境下生长的细菌与其近缘细菌的基因组序列，能为揭示极端微生物特殊表型的分子基础提供重要线索；而通过基因组序列比较，分析一些近缘细菌或同一细菌不同菌株间基因的缺失及获得，可以得到有益的进化信息。

但是毕竟进行全基因组测序耗资巨大，利用已经公布的细菌全基因组序列，制备涵盖全部ORF 的DNA 芯片，可以在很大程度上满足全基因组比较的需要。

2.3 微生物检测鉴定研究
DNA 芯片可以同时固定大量探针分子，是微生物通用检测方法的理想选择。

利用DNA 芯片进行微生物通用检测的策略主要有两种，一是选择细菌种保守的16S 和23SrRNA 等基因中能代表种特异性的片段作为探针，利用通用引物扩增标记待鉴定的菌株，进行杂交；另一个则是选择待检测微生物的特异性基因作为探针，利用多重PCR 扩增标记。

两者都需要有目的片段的扩增过程，才能达到检测所需的灵敏度。

3 DNA 芯片应用展望
DNA 芯片的制备需要有专门的仪器，价值不菲，这在一定程度上限制了其更广泛的应用；值得庆幸的是，一些独具慧眼的生物技术公司已经开发了一些模式微生物的DNA 芯片，如金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和大肠杆菌等，这些芯片基本可以涵盖该微生物的全部推定ORF，为研究人员提供了极大的便利。

相信在最近的几年内，还会有更多的微生物DNA 芯片问世。

结语
我们在上面列举了第三代基因编辑技术、RNA 干扰技术、DNA 芯片的在微生物学研究应用，虽然它们有很大的优势，能方便的运用于微生物学的研究，但是任何一种技术方法都不是万能的，它们都存在着或多或少的问题有待解决。

在可以预见的未来一段时间内，这些技术是微生物学研究中的重要工具，会大规模的被使用以及被完善。

它们必将为研究者提供更为丰富的信息，从而推动微生物学科的整体发展。

参考文献
[1] Kim Y G, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to fok Ⅰcleavage domain. Proc Natl Acad SciUSA, 1996, 93 (3): 1156-1160
[2] Urnov F D, Rebar E J, Holmes M C, et al Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet, 2010, 11(9):636-646
[3] Cogoni C, Romano N, Macino G．Suppression of gene expression by homologus transgenes [J]．Antonie Van Leeuwenhoek,1994,65(3):205－209．
[4] Guo S, Kempheus K J．PAR1, a gene required for establishing polarity in C．elegans embryos, encodes a putative Ser ／Thr kinase that is asymmetrically distribute [J]．Cell, 1995,81:611－620．
[5] Hannon G J．RNA interference[J]．Nature, 2002,418(6894):244－251．
[6] Bernstein E, Caudy A A, Hammond S M, et al．Role for abidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J]．Nature, 2001,409(6818):363－366．
[7] Reinhart B J, Slack F J, Basson M, et al．The 21－nucleotidelet －7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J] Nature, 2000,403(6772):901－906．
[8] Pal－Bhadra M, Bhadra U, Birchler J A．RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila[J]．Mol Cell, 2002,9(2):315－327．[9] Williams B R．Role of the double－stranded RNA activated proteinkinase (PKR) in cell regulation [J]．Biochem Soc Trans,1997,25:509－513．
[10] Jacson A L, Bartz S R, Scheter J, et al．Exprossion profiling reveals off－target gene regulation by RNAi [J]．Nat Biotechnol,2003,21:635－637．。