单克隆抗体论文

单克隆抗体的研究进展

摘要：抗体分子是生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子。上世纪30～60 年代对抗体的理化性质以及对免疫球蛋白分子结构与功能的研究取得了突破性进展。1976 年德国学者Kohler和英国学者Milstein 创建杂交瘤技术，首次成功地制备了小鼠单克隆抗体（McAb）即第二代抗体。80 年代早期开始了基因工程抗体即第三代抗体的研究。基因工程抗体指通过基因工程方法改造和制备抗体，它兴起于对鼠单抗的人源化改造，至90 年代初产生的抗体库技术将基因工程抗体的发展推向了高潮，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。

关键词：单克隆抗体；人源；基因工程；研究进展

单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。目前比较成熟的制备方法有以下几种：（1）抗原特异性的 B 淋巴细胞杂交瘤技术；（2）人- 鼠嵌合抗体制备技术；（3）噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；（4）转基因小鼠制备的人mAbs；（5）核糖体展示技术。通过这些方法，我们利用相应的抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发展。以下主要是对抗体制备技术的发展及其应用研究进展进行综述。

1 鼠源性抗体技术（杂交瘤技术）

1.1 杂交瘤技术的基本原理

1975 年，Kohler 和Milstein 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B 细胞- 浆细胞、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增殖、分裂，同时在选择培养基作用下。利用代谢缺陷补救机筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体（MCAB）。它在分子结构，氨基酸序列以及特异性方面都是一致的。淋巴细胞杂交流技术的主要步骤包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗的鉴定等。

1.2 杂交瘤技术的的优、缺点

至今，科学家们已经建立众多鼠原性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源性单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免

疫反应，产生人抗鼠抗体，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合。为了克服以上这些问题，今年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人- 鼠契合抗体、人源化抗体或全人抗体。

2 人源单克隆抗体的研制

2.1 噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进展，是把人淋巴细胞谱中的VH 和VL 基因片段，通过RT- PCR 技术进行克隆和扩增，并随机组合到表达载体上，构建出大容量的人源性抗体库。同时，利用噬菌体展示技术能将特定分子的基因型和表型相统一的特点，即噬菌体表面表达了特定的蛋白质，则噬菌体的DNA中必然含有该蛋白质相应的结构基因，通过多次的“吸附- 洗脱- 扩增”的筛选富集过程，就可以有效地筛选出特异性的人源性抗体的可变区基因，从而制备出人源性单克隆抗体。初次用噬菌体抗体库技术所获得的人源性单抗其亲和力往往比较低，难以达到实用要求。随着近几年体外亲和力成熟技术的进步，可筛选出亲和力提高103 倍的抗体，接近甚至超过杂交瘤技术所能达到的亲和力水平。

2.2 核糖体展示技术

核糖体展示是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的有力工具。Mattheakis 等人在1994 年建立了体外核糖体展示随机肽系统，利用“蛋白质- 核糖体- mRNA”三元复合物在体外将基因型和表型联系起来。随后Hanes 和Plukthun 等在此基础上对该技术加以完善和改良，正式建立了这种体外筛选技术。该技术的基本原理是利用PCR 扩增含目的基因的cDNA 文库，再加上启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/ 翻译欧联系统作用下，形成“蛋白质- 核糖体- mRNA”三元复合物，用相应抗原对反复筛选复合物，分离mRNA，通过RT- PCR 富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。

核糖体展示技术与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统，无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主菌生长的影响，不受体内环境的的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。此外，核糖体展示技术无需进行体内外系统转化，全程只需通过PCR 技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR 技术还可引入突变，增加分子多样性，从而获得高亲和力抗体。目前还有很多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性，如三结构域抗体（VH/K）可以明显改进ScFv 的稳定性。而核糖体展示技术最大的缺点就是mRNA 易降解。目前研究表明，氧钒核糖核苷复合物

（VRC）作为过渡阶段的类似物发生作用，可有效的一致核酸酶，提高mRNA 的稳定性。另外“蛋白质- 核糖体- mRNA”三元复合物的稳定性也比较差，但可通过在缓冲液中加入一定浓度的镁离子交联核糖体RNA 的磷酸集团抑制核糖体复合物的解离。

3. 足抗体的临床应用及其最新进展

从鼠源单抗开始，已通过多种技术制备了具有高亲和性的完全人源化抗体，最为靶向治疗多种疾病的新型药物。其中由杂交瘤技术制备的单克隆抗体不仅结果均一、纯度高、特异性强、血清交叉反应弱、而且制备成本低，而基因工程抗体既保持单抗的均一性、特异性强等优点，又能克服其为鼠源性的不足，因此，拓展mAbs 的广泛应用，是研究开发治疗性抗体药物的最理想的途径。近30 年来，在基因工程抗体方面的研究成果振兴了整个生物制药行业。目前，全球约有500 多种治疗性药物正处于临床前研究，100 多种已处于临床试验中。其中，已被FDA 批准的有治疗性淋巴瘤的Rituximab，治疗乳腺癌的Herceptin，以及抗肿瘤坏死因子的契合mAb（infliximAb）对克隆病等自生免疫疾病方面的治疗作用。另外还有一些抗体药物在一直器官移植术后排斥反应和病毒感染性疾病等方面也显示了较好的应用前景。此外抗体还可能执行除目前所具有之外的更多功能。如Yamazaki 等今年来新研究出的等位基因特异抗- HLA 单克隆抗体（ASHmAb）,可用于干细胞移植的组织相容性抗原分型的临床诊断。抗体疗法是一门动态科学，它随着技术的成熟而获得发展。但目前技术还不成熟，据报道，曾有6 个健康志愿者在英国因参加关于CD28 靶向mAb、TGN1412 的一期临床试验，而被送往重症监护室。因此，虽然靶向抗体药物疗法的基本原理早在10 年前就已被提出，但是它离实际的临床应用尚有距离。目前，该方法还在不断的发展和完善，主要的目标是能在兼顾亲和力和免疫活性的同时，降低抗体的异源性，从而建立更好的抗体疗法。而据多方实验表明，抗体疗法的主要障碍在于全人源性抗体的生产和抗体药物的靶向作用问题。生物多价体Fv 作为新型免疫分子的模板，以及体内抗体靶向治疗问题（如稳定性、安全性、生产成本和生物干扰等）将成为下一代抗体药物治疗临床试验研究的新热点。