疟原虫镜检技术

•
甘油
3ml
•
纯甲醇
97 ml
• 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油
充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒 入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中 的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。 充分摇匀，一般放置一二星期后，再过滤
应用（保存时间愈久，染色力愈佳）。
• 急用时，放置24小时后过滤也可使用。
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（2）缓冲液的配制
PH M/15 Na2HPO4 M/15 KH2PO4
(ml)
( ml)
DW (ml)
6.8
49
51
900
7.0
63
37
900
7.1
68
32
900
7.2
73
27
900
7.4
81
19
900
• 加缓冲液的PH可用试纸或0.02%酚红液测定。
• 亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂
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可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好。
• （1）两种贮备液的配制：
• 贮备液I • •
1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液
Na2HPO4 9.5 g 蒸馏水 1000 ml
• 贮备液Ⅱ 1/15M磷酸二氢钾 （KH2PO4 ）溶液
•
KH2PO4 9.07 g
•
蒸馏水 1000 ml
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一、显微镜镜检用于疟疾诊断
• 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断
技术(金标准）
• 主要优点
- 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序
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二、血片制作及染色
1. 所需设备
（1）载玻片 （2）采血针 （3） 玻片盒 （4） 75％乙醇棉球 （5） 铅笔 （6） 登记表
充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。
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3.染色质量
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• 染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不 应该出现蓝—绿色或红色）； • 镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜 红色，淋巴细胞及疟原虫的胞浆呈蓝色或淡蓝 色，白细胞的核呈紫蓝色； •疟原虫的核呈红色，疟色素清晰可见，在显微 镜下仅有小量染液沉淀。
（一）薄血膜的涂制：
用棉球抹净角上的血渍， 再刮取血液1.5μl{约1/4 火柴头大小)，将推片的 一端置于血滴之前，当血 液在载玻片与推片之间向 两侧扩展至约2cm宽时， 使两玻片保持25-35°角， 从右向左迅速向前推成舌 状薄血膜，长约2.5CM。
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• （3）厚薄血膜的位置： • 每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。
• （2）染色方法：
•
• 先用腊笔在厚薄血膜间画一界线，滴2-3滴蒸
馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（小心勿使蒸馏 水超出腊笔线而触及薄血膜）。
• 在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等
量的蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚 血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清 水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。
为甚。通常在染液配制1-2周后才使用。
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(3)染液的稀释浓度：
• 染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色
粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使 用
• 染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色
偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。 (4)染色时间与温度：染色时间长，化学反应
标准血膜的位置如下图所示。
• （4）血膜的编号
• 制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个人
编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果报告 单上的编号相一致，以防差错。
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标准血膜示意图
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（二）血片的染色
1．薄血膜的固定 血片完全干燥后才可染色
摇匀，在室温下放置3-5天，每天摇动，即可使 用。放置时间越长染色效果愈佳。
资料仅供色
• 用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与
缓冲液1：20稀释。
• 分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜，
染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上 的染液冲去，（冲洗时勿用水直接对准厚血膜， 以免血膜脱落）凉干后镜检。
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2．血片制作
（1）取血部位 采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血
（2） 涂制血膜 厚血膜的涂制：
用推片的左下角刮取血液 4-5μl（约火柴头大小）， 将血滴涂于载片的中央偏右， 由里向外划圈涂成直径为 0.8-1厘米的厚薄均匀的圆 形厚血膜。
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B. 快速吉氏染色
• 在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（10-
15%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上， 染色5分钟，用流水轻轻冲洗干净，凉干后镜 检。
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• 瑞氏（Wright）染液:
• （1）染液配制：
•
瑞氏染剂粉 0.1—0.5g
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4. 影响血膜染色的因素
血膜染色好坏，除与玻片的清洁、血膜制作技 术等有关外，尚与下列因素有关： (1)试剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不 纯，常使所配的染液偏酸或偏碱，从而影响 血膜的染色。 (2)染液的新旧：新配制的染液，因色素尚未充 分溶解，一般染色力弱，且常带碱性。染液 放置较久，染色力逐渐增加，尤以吉氏染液
• （1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：
• 吉姆萨粉 10g
• 甲醇
500ml
• 甘油
500ml
• 将吉姆萨粉置于研钵中，加入少量甘油充分研 磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入
500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇洗 涤掉剩余部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒入 瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充分
• 固定的方法：
将涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放 置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以 固定薄血膜。 （注意：厚血膜不能固定）
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• 2． 染色用水和冲洗用水配制
• 常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。用pH7.0～
pH7.2的缓冲液效果最佳。在没有蒸馏水的情况下，也