微生物细胞破碎(1)
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
工艺学3-细胞破碎
第三章
第一节 第二节 第三节
（二）高速珠磨机 （High speed bead mill）
第三章
第一节 第二节 第三节
高速珠磨机工作原理
磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园 盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离 小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层 之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
（二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节 第Байду номын сангаас节 第三节
方法 匀浆法
机 械 珠磨法 法
超声波
表 3-1 常用的细胞破碎方法
原理
特点
基于液相的剪切力
适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广 泛应用，但不适用于某些高度分支的微生物，另 外产热大，可能造成生物活性物质失活
利用研磨作用破碎
胞 内 冰 晶 引 起 细 胞 膨 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅
胀破裂
适于在实验室中使用
渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 胞快速膨胀破裂
化学试剂处理 应 用 化 学 试 剂 溶 解 细 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，
胞 或 抽 提 某 些 细 胞 组 可应用于大规模生产
第三章
第一节 第二节 第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂
（二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节 第二节 第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨
细胞破碎(cell disruption)
细胞破碎（cell disruption）定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.1细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌，肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁具有很高的机械强度2 细胞破碎技术机械法和非机械法2.1机械法机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法高压匀浆器影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法2.2 非机械法非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等.1)酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。
酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。
酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.渗透压冲击法冻融法干燥法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
微生物细胞的破碎
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
第三章 细胞破碎解读
有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲素（Urea） 是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点：
（5）化学渗透法 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地 渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结 构与组成。
表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。
原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力作用下破碎。
压力：50~70MPa 速度：450m/s
高压匀浆器针型阀结构简图
高压匀浆器各种阀型设计
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难 破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环 的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程， 被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方 程可表示为：
EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结
构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维
持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂 来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。
现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下：关键词：细胞破碎机械法酶法（一）细胞破碎的定义1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
2.破碎各种细胞的主要阻力：2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度;2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度;2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。
(二) 细胞破碎的方法1.机械法1.1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器（High pressure homogenizer）操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。
料液细胞浓度：20%左右。
☆团状和丝状菌，不宜使用。
注意事项：（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。
（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。
（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合该法处理【1】。
1.2珠磨机研磨珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
工作原理：细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起，磨室配有冷却夹套。
注意事项：操作参数较多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。
生物分离工程第二章细胞破碎
常用离心设备
Decanter centrifuge
Multichamber bowl, vertical cut
管式离心设备
A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper
Tubular bowl
碟片离心设备
fg fS fb
则
v
2 g
4 3
S
L
L
d
p
g
重力沉降理论
当球形颗粒处于滞流区（103 Re 1 ）时 Biblioteka 24Revg
d
2 p
S
L g
18 L
Stokes公式
当球形颗粒处于过渡区（1 Re 103 ）时
10
Re 0.5
vg
0.27
操作过程区带离心种类?差速区带离心速度区带离心平衡区带离心等密度离心?平衡区带离心等密度离心差速速区带离心差速区带离心?基于颗粒的大小形状的分离?梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?动态离心分离方法平衡衡区带离心平衡区带离心?梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?平衡离心分离方法梯度液的种类和应用细胞分离区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止短时间低速度使各组分沉降到其平衡的密度区长时间高速度离心方法新进展具体表现在哪几个方面
细胞破碎方法简述
细胞破碎方法简述-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1细胞破碎方法简述2010-04-26 09:27:19|?分类：电泳资料 |标签： |字号大中小订阅本文引用自啸月天狼《细胞破碎方法简述》更多相关资料请查看分离膜是指能以特定形式限制和传递流体物质的分隔两相或两部分的界面。
膜的形式可以是固态的，也可以是液态的。
被膜分割的流体物质可以是液态的，也可以是气态的。
膜至少具有两个界面，膜通过这两个界面与被分割的两侧流体接触并进行传递。
分离膜对流体可以是完全透过性的，也可以是半透过性的，但不能是完全不透过性的。
膜在生产和研究中的使用技术被称为膜技术。
随着科学技术的迅猛发展和人类对物质利用广度的开拓，物质的分离已成为重要的研究课题。
分离的类型包括同种物质按不同大小尺寸的分离；异种物质的分离；不同物质状态的分离等。
在化工单元操作中，常见的分离方法有筛分、过滤、蒸馏、蒸发、重结晶、萃取、离心分离等。
然而，对于高层次的分离，如分子尺寸的分离、生物体组分的分离等，采用常规的分离方法是难以实现的，或达不到精度，或需要损耗极大的能源而无实用价值。
具有选择分离功能的高分子材料的出现，使上述的分离问题迎刃而解。
膜分离过程的主要特点是以具有选择透过性的膜作为分离的手段，实现物质分子尺寸的分离和混合物组分的分离。
膜分离过程的推动力有浓度差、压力差和电位差等。
膜分离过程可概述为以下三种形式：①渗析式膜分离料液中的某些溶质或离子在浓度差、电位差的推动下，透过膜进入接受液中，从而被分离出去。
属于渗析式膜分离的有渗析和电渗析等；②过滤式膜分离利用组分分子的大小和性质差别所表现出透过膜的速率差别，达到组分的分离。
属于过滤式膜分离的有超滤、微滤、反渗透和气体渗透等；③液膜分离液膜与料液和接受液互不混溶，液液两相通过液膜实现渗透，类似于萃取和反萃取的组合。
溶质从料液进入液膜相当于萃取，溶质再从液膜进入接受液相当于反萃取。
微生物细胞破碎原理与技术
对于含有酶的细胞破碎产物，酶的活性是评价产物质量的重要
指标。
细胞内重要代谢物
02
对于特定微生物细胞破碎产物，细胞内的重要代谢物的含量也
是评价产物活性的指标之一。
细胞免疫活性
03
对于具有免疫活性的细胞破碎产物，免疫活性是评价产物质量
的重要指标。
04
微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物细胞破碎技术的发展前景
微生物细胞破碎的应用
80%
蛋白质提取
通过破碎微生物细胞，可以提取 和纯化细胞内的蛋白质，用于酶 工程、生物制药等领域。
100%
酶的提取
酶是微生物细胞中的重要组成部 分，通过破碎细胞可以提取各种 酶，用于催化化学反应和工业生 产。
80%
代谢产物的提取
微生物在生长过程中会产生许多 具有生物活性的代谢产物，通过 破碎细胞可以提取这些产物，用 于药物研发和生物技术领域。
颗粒物质，提高破碎效果；在破碎后进行后处理，如离心、过滤、纯化
等，提高产物的纯度和质量。
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破碎能耗
破碎过程中的能量消耗也是评价破碎效率的指标之一。
细胞破碎产物纯度评价
02
01
03
杂质含量
破碎产物中杂质的含量越低，产物的纯度越高。
蛋白质含量
破碎产物中蛋白质的含量也是评价产物纯度的指标之 一。
细胞内含物残留
破碎产物中细胞内含物的残留量越少，产物的纯度越 高。
细胞破碎产物活性评价
酶活性
01
微生物细胞破碎原理与技术
目
CONTENCT
录
• 微生物细胞破碎概述 • 微生物细胞破碎技术 • 微生物细胞破碎效果评价 • 微生物细胞破碎技术的前景与挑战
微生物技术应用：第四章-微生物发酵产物的分离与纯化可编辑全文
3 工艺放大
发酵产物分离纯化工艺的建立一般都经过从 实验室、中试车间生产到形成工业规模生产线的 放大过程，这是一项工艺诞生、发展、成熟和完 善的一般规律。其中实验室研究是大规模生产的 第一步，小规模生产工艺是大规模生产工艺的基 础。尽管工艺放大过程中往往会有操作细节或条 件的改变，小规模生产工艺条件优化和工序综合 效果研究可为放大设计及工艺定型积累数据和提 供经验。
（一）发酵液的预处理和固液分离
1.高价无机离子的去除方法
（1）钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小 ，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。 反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高 滤液(也称为原液)质量。但草酸价格较贵，应 注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸 铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在 90~95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶 后可以回收草酸。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
WSK卧式高效全能珠磨机 ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
（2）高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用
方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀， 由于突然减压和高速冲击撞击环 造成细胞破裂。
JJ-2组织捣碎匀浆机
（2）高压匀浆器
各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率
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a
1
细胞破碎的必要性
酶 L-天冬酰氨酶
过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶
葡萄糖氧化酶
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 蔗糖酶
青霉素酰化酶
表1 胞内酶举例
来源 Eruinia Caratovora
Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous
不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中 的位置等也是应考虑的因素。
a
18
有研究表明，减小磨珠直径起先会提高 卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小 一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。
eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃 珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶时，则最好 使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。
a
19
在一定范围内，增加珠体装填量可以提高 细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细 胞破碎和蛋白质的释放。
为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率， 这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。
一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%90%，并随珠体大小变化。
a
20
细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响， 最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用 Netzsch LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制 在40%左右。
微生物
革兰氏阳性 革兰氏阴性
细菌
细菌
酵母菌
霉菌
壁厚/nm 层次
20~80 单层
10~13 多层
100~300 多层
100~250 多层
主要组成
肽聚糖（40 肽聚糖（5 ％～90％）、 ％～10％）
多糖、胞壁 脂蛋白、脂 酸、蛋白质、 多糖（11
脂多糖（1 ％～22％） ％～4％） 磷脂、蛋白
质
葡聚糖（30 ％～40％）
在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用
葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除
临床分析 糖果、蜜饯
2
苄青霉素的脱酰作用
表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名 胰岛素 人生长激素（HGH） α-干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
用途 治疗糖尿病 治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血病 和卡波济肉瘤
a
3
细胞壁的组成与结构
作用机理：空化现象
由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲 击波的现象。
a
28
超声波振动在液体中传播的音波压强 达到1atm时，功率密度为0.35 w/cm2，这时 超声波的音波压强峰值可达真空或负压， 但实际上无负压存在，因此在液体中产生 一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一 空化核。此空洞非常接近真空，在超声波 压强反向达到最大时破裂。
a
21
Currie等人的研究表明，操作温度控制在 5-400C范围内对破碎物的影响较小。
常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨 室的温度。
a
22
常用的破壁方法——高压匀浆
作用机理：液体剪切作用
a
23
图5 高压匀浆机装置图
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀
球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种阀型设计
a
24
珠磨法
机
高压匀浆法
械 法
超声波破碎法
X-press法
酶溶法
非
化学渗透法
机 械 法
渗透压法 冻结融化法
干燥法
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常用的破壁方法——珠磨法
作用机理：固体剪切作用
图3 水平搅拌式珠麿机结构示意图
1—细胞悬浮液 2—细胞匀浆液 3—珠液分离器 4—冷却液出口
5—搅拌电机 6—冷却液进口 7—a 搅拌桨 8——玻璃珠
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8
N0和N的确定方法： ▪ 直接计数法：通过平板计数技术或血球细
胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后 的样品进行计数。
▪ 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液 中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性 蛋白、酶等）。
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9
细胞破碎技术
a
10
其他新的细胞破碎方法：
▪ 激光破碎法 ▪ 冷冻-喷射法 ▪ 高速相向流撞击法
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此方法中影响破碎的主要因素是压力、 温度和通过匀浆器的次数。
有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在 450-750kg/m3时，温度由500C提高到300C，破 碎率约提高1.5倍。
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图7 细胞浓度及压力大小对破碎率的影响
匀浆次数
a
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图8 匀浆次数对破碎效果的影响
常用的破壁方法——超声波破碎
应用范围 治疗急性淋巴癌
牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析
Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis
Aspergillus niger Penicilluim notatum
Yeast Saccharomyces
Cerevisaiae Escherichia Coli
甘露聚糖 （30％）、 蛋白质（6 ％～8％）、 脂类（8.5 ％～13.5）
多聚糖（80 ％～90％）脂
类、蛋白质
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4
图1 革兰氏菌细胞壁结构图
a
5
（a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌
图2 酵母细胞壁的结构示意图
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6
M—甘露聚糖； P—磷酸二酯键； G—葡聚糖
微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁 的组成以及它们之间相互关联的程度。
a
29
图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图 图1a0 USB600型微电脑控制超声波细胞粉3碎0 机
a
11
表3 细胞对破碎的敏感度
细胞
声波
搅拌 液压
动物细胞
7
7
7
革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌
6
5
6
革兰氏阳性芽孢杆菌 酵母
革兰氏阳性球菌 孢子 菌丝
5
(4)
5
3.5
3
4
3.5
(2)
3Leabharlann 2(1)2
1
6
(1)
冷冻压力 7 6 4 2.5 2.5 1 5
注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。
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常用的破壁方法
内因：连接细胞壁网状结构的共价键。
外因：各类微生物的遗传信息、培养条 件、菌龄、外界环境等。
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7
破碎程度的评价
破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数，即：
Y（%）=[（N0-N）/N0]*100 其中N0——原始细胞数量；
N ——经t时间操作后保留下来的未损 害完整细胞数量。
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a
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破碎作用遵循一级动力学定律：
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破碎的速率和效率是所有操作参数的函数， 如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、 操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。
此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构 也有关系，如转盘外缘速度等。
a
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一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快， 但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体 中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好， 工业规模不得小于0.4mm。