农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的

第32卷第2期2013年2月绵阳师范学院学报Journal of Mianyang Normal University Vol．32No．2Feb．，2013

收稿日期：2012-

12-30基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009－091B ），国家自然科学基金（30871555），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET －08－0940），四川省教育厅（09ZA034）、西南科技大学博士研究基金（11zx7104）和农业部公益性行业科研专项（201103007）作者简介：张思维，硕士研究生，主要从事植物遗传与抗逆研究

*通讯作者：代其林，博士，副教授，研究方向为植物遗传与抗逆研究．E －mail ：daiqilinmj@．sina．com

农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究

张思维，周文波，张新，陈翠娜，代其林*

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621000）

摘要：耐辐射奇球菌(D．radiodurans ，DR )在极端胁迫条件下能够继续生存，其耐辐射奇球菌基因组中(DR

R1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究．DR 1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因，其蛋白序列存在一个Why 功能域，此功能域可能参与了植物的抗旱过程．我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372－GV3103表达载体，然后利用花序浸染法成功将目的基因DR 1372转入拟南芥中，最后对阳性植株进行盐胁迫，证实了DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．初步建立了农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥体系，为后续DR 1372基因的功能研究工作提供了理论基础．

关键词：DR 1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥

中图分类号：O175.12文献标识码：A 文章编号：1672-

612x （2013）02-0057-080引言

目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性．按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类：第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基

因；第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］．Pibn －

Smits 等将otsA 和otsB 导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活

性提高［2］．Kishor 等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS 基因与CaMV35S 启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍；干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增

加2倍［3］．Capell 等发现Adc 在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，

并提高了水稻的抗旱性［4］．由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植

物的耐旱性，

与抗旱相关的转录因子有DREB 、MYC /MYB 、bZIP 、WRKY 和NAC 类等，其中MYB /MYC 是植物中最大的转录因子家族．Chen 等发现了小麦中23个MYB 转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］．

耐辐射奇球菌（D．radiodurans ，

DR ）是Anderson 等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，

目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA 损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］．White 等在1999年公布了DR R1的完全

基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］．DR R1基因组

可以在一个细胞中完成DNA 修复，DNA 损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功

能．Battista 等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］．DR1372基

因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因．对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy 功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中

的WHy 功能域结构非常相似［9］．WHy 结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这

些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N 末端都存在一个非蛋白氮（NPN ）结构．同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy 功能域的存在，最终推测WHy 结构域是参与植物水分胁迫应

答以及超敏应答的一类功能域［9］．脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy 功能域，它

们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA 、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积

累［10、11］．由于WHy 功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR 1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因．因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR 1372－GV3103表达载体，将DR 1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR 1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR 1372的功能研究包括WHy 功能域的功能研

究奠定了基础，

对植物育种工作也有一定的指导意义．1

实验材料1．1植物材料

拟南芥野生型col －0生态型

1．2菌株

DR 1372+Z3（DR 菌内与干旱相关的基因DR 1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌），JM109，JM109，GV3103

2

实验方法2．1构建DR 1372－GV3103植物表达载体

2．1．1DR 1372基因的引物设计

根据DR 1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物（分别命名为DR 1372－F ，DR 1372－R ）；根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI ，SacI 限制性酶切位点，并设计引物如下：

Sence ：5＇－－－－－－GC TCTAGA ATGAAGAAGATGGCTTTTGCG －－－－－3＇

Antisence ：5＇－－－CG AGCTC TCAAAACACCGATAAAGGCGC －－－－3＇

（加粗标记示酶切位点）

2．1．2PCR 扩增目的基因DR 1372

用试剂盒（TIANGEN ）提取DR 1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR 扩增．电泳验证．

2．1．3质粒pBI121的提取

用试剂盒（TIANGEN ）提取pBI121质粒．电泳验证．

2．1．4PCR 产物胶回收

PCR 产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（TIANGEN ）回收扩增的目的片段DR1372和pBI121．电泳验证．

2．1．5DR 1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定

2．1．5．1目的片段DR 1372和pBI121质粒用XbaI ，SacI （购自Takara 公司）进行双酶切，37ħ酶切过夜，回收目的片段．

2．1．5．2将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16ħ连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞．

2．1．5．3阳性克隆检测：进行菌落PCR 初步鉴定，将PCR 检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序．

2．1．6挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌．将保存菌种摇菌提取质粒，得到DR 1372－GV3103植物表达载体．

2．2花序浸染法转化拟南芥

2．2．1培养基：

MS 培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素（Kan ，50mg /ml ）

Hoagland＇s （霍格兰氏）液体培养基

药品试剂：

乙酰丁香酮（AS ）Silwet －L77表面活性剂

2．2．2拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养

选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1min ，然后用无菌水洗2遍；再用2．5%NaClO 消毒5min ，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4ħ冰箱春化2d 后进行铺板．

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绵阳师范学院学报（自然科学版）