凝血四项操作规程

凝血四项操作规程

1.目的

规范凝血四项（PT、APTT、TT、FIB）的测定。

2.实验原理

凝固法原理：在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后，加入试剂后，采用波长为660nm 的光照射样本。凝血过程（纤维蛋白原转化为纤维蛋白）中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定，可以做出凝血曲线，通过Percentage Detection Method法求得血液凝固时间。

3.标本要求

3.1.标本准备：采用塑料采血管或硅化玻璃注射器静脉采血，针头必须为21号以上，儿童可用23号。采血技术熟练，采血时止血带不可束缚过紧，并且以1分钟完成为宜，最多不宜超过3分钟以免某些凝血因子及纤溶因子活化。

3.2.抗凝剂选择：以109mmol/L枸椽酸钠溶液为佳，血与抗凝剂按9：1混合。建议用已加有抗凝剂的硅化真空采血管。也可用带盖塑料管或硅化玻璃管，但应保证血与抗凝剂的比例正确。

3.3.收到血标本后应尽快离心分离血浆，并尽快测量，全血储存在4-8℃不应超过2小时，室温下富含血小板血浆可存放3小时，去血小板血浆可存放2小时；4小时内不能测定的血浆应冷藏；不要把血浆置于37℃条件下超过10分钟。应了解不同存放温度和时间对各种凝血因子活性检测的影响。

4.材料

4.1.试剂的选择一方面要根据所用检测仪器，例如：光电检测法的凝血仪不宜用透光度差的试剂；另一方面要根据实验试剂对疾病的敏感性，例如APTT试剂中所用活化剂不同（可用白陶土、硅藻土和鞣花酸），该试剂对肝素、凝血因子Ⅷ和因子Ⅸ缺乏及狼疮样抗凝物敏感性不同，所以需根据检测项目来选择不同活化剂。(例如常用的APTT试剂的活化剂，以白陶土对凝血因子敏感，硅土对因子及肝素均敏感，鞣花酸对狼疮样抗凝物敏感性较强.PT试剂的选择也一样,例如对口服抗凝药物(华法令)检测应选择ISI与1.0接近的PT试剂。)血栓与止血检验应尽可能选用仪器生产厂家推荐的配套试剂，并选择使用与仪器原理相匹配的试剂。

4.2.正常对照血浆：正常对照血浆有商品供应，多为冻干品，也可自制，要求采集20份以上男女各半，年龄在18-25岁之间的健康个体，删除服药者，须在平静状态下采血，血液经抗凝离心后分离血浆。取等量的各份个体血浆进行混匀，然后分装小瓶，冻存于-80℃或冷冻干燥备用。

4.3.参比血浆或称标准血浆（质控血浆）：为了使检测结果在同一实验室的不同时期或不实验室间具有可比性，就要使用标准品。

5.仪器与试剂

5.1仪器：深圳锦瑞CA-54半自动化血凝分析仪。

5.2试剂：上海太阳生物技术有限公司。

5.3仪器安装后应对其主要性能参数进行评价，内容包括精密度、线性范围、可比性、抗干扰试验试验等。评价结果应在仪器说明书标示范围之内。

6.3.2 设置测试项目和病人编号：方法同6.1.2

6.3.3 加血浆30ul于空比色杯内，置于测试通道或预温位预温2分钟。

6.1.4 当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道4”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取30ul 已预温好的TT试剂加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。

6.1.5 质控品：操作方法同样品。

6.1.6 关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。

6.3 FIB检测步骤

6.3.1 打开电源开关，仪器自检后进入主菜单页面，然后按“1”进入“测量标本”子菜单。

6.3.2 设置测试项目和病人编号：方法同6.1.2

6.3.3 加血浆40ul于空比色杯内，置于测试通道或预温位预温3分钟。

6.1.4 当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道2”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取20ul 已预温好的FIB试剂加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。

6.1.5 质控品：操作方法同样品。

6.1.6 关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。

7.质量控制

7.1质控品跟随常规标本一起测定，意即质控品必须与患者标本在同样条件下进行检测，建立质控图信息后，以判断结果是否在控。

7.2为了使检测结果在同一实验室的不同时期具有可比性，必须使用标准品或参比血浆进行室内质量控制。

8.参考区间

PT：10-14秒。待检者的测定值较正常对照延长3秒以上有临床意义。

APTT：22-38秒。待检者的测定值较正常对照延长10秒以上有临床意义。

TT：10-16秒

FIB：200-400mg/dl

9.注意事项

9.1血栓与止血实验的质量控制和标准化是实验结果可靠性、可比性的基本保证。其实验项目繁多，现阶段大部分是应用形成可见的纤维蛋白丝为终点。这种方法所采用的均为生物性材料，其凝血活性或抗凝、纤溶活性可随时间、温度、生理变化、个体差异而变化，故其质量控制更为重要。

9.2 要重视检测前的质量控制，包括合理的标本采集和处理；试剂的选择；器材、仪器、质控品、正常对照品的质量保证。

9.3 实验操作时应警惕许多实验误差来源于技术错误。在实验技术、试剂、温度及PH值上微小的变化都有导致试验结果明显的变化。例如，在一期法PT测定时孵育时间和温度应严格控制。血浆绝不能在37℃放置超过10分钟；凝血活酶放置时间也不能超过说明书所规定的期限。

10.临床意义：

10.1 PT检测的临床意义

10.1.1 PT延长

a.外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低，如先天性某因子缺乏症和低（无）纤维蛋白原血症，但均很少见，获得性的见于DIC、原发性纤溶、维生素K缺乏症、肝脏疾病等。

b.血循环中抗凝物质增加，如肝素或FDP增多等。

10.1.2 PT缩短

口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。

10.1.3 用于香豆素类等口服抗凝剂的监控

10.1.3.1一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右（1.3—2.5倍）即25—30s，或PT R为1.3—1.5（最大不超过2）为宜。

10.1.3.2 PT%应控制在40%以上，减低到40%有出血倾向。

10.1.3.3不同情况下口服抗凝药治疗的最佳抗凝强度时INR的范围：

a.术前两周或术中口服抗凝药，INR为1.5—3.0；

b.原发或继发静脉血栓的预防，INR为2—3；

c.活动性静脉血栓、肺梗塞、复发性静脉血栓的预防，INR为2—4；

d.动脉血栓栓塞的预防，心脏换瓣术后，INR为3—4.5。

10.2 APTT检测的临床意义

10.2.1.受检者的测定值较正常对照延长超过10s以上才有病理意义。

10.2.2 对内源凝血途径因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏较CT敏感（血小板异常不影响APTT）能检出Ⅷ：C小于25%的轻型血友病。对凝血酶原、纤维蛋白原缺乏则不够敏感，故APTT延长的最常见疾病为血友病。此时可进一步做纠正试验，即于患者血浆中加入1/4量的正常新鲜血浆、硫酸钡吸附血浆或正常血清（试剂参见凝血酶原消耗试验的纠正试验），再做APTT，如正常血浆和吸附血浆能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子Ⅷ缺乏；如吸附血浆不能纠正，其余两者都能纠正，则为因子Ⅸ缺乏；如三者都不能纠正，则为病理性循环抗凝物质。

10.2.3 在使用肝素治疗时，多用APTT监测药物用量，一般以维持结果为基础值的2倍左右（1.5—3.0倍）为宜（75—100s之间）。但应事先检测所用部分凝血活酶试剂是否对肝素敏感，即向正常人血浆中加入不同量肝素（从每毫升0.1—1.0IU），看其APTT是否相应延长。

10.3 TT检测的临床意义

10.3.1 TT延长：患者血循环中AT-Ⅲ活性明显增高，肝素增多或类肝素抗凝物质存在，如SLE、肝病肾病等，异常纤维蛋白原血症，低（无）纤维蛋白原血症，