实时定量PCR说明书(2)
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
7500 实时荧光定量 PCR 系统手册说明书
7500 Real-Time PCR System ManualAMPLIFICATION CURVES ANALYSIS CREATE THE TEMPLATEOpen the software and select New Experiment . To perform further analysis of results with the Genvinset ® Report Viewer software, it is important to correctly create the template before the run.1. Set up the experiment properties and in Experiment type, select Quantitation - Standard Curve .2. Go to Setup > Plate Setup ,a) In the Define Targets and Samples tab, add new targets, name the genes and select the reporter asspecified in Figure 2. For multi-reaction kits, add the target genes of all reactions. b) In the Assign targets and Samples tab, select none as passive reference.3. In the Setup > Run Method tab set the amplification program.4. To save the setup of the experiment to use it on further occasions, click ok File > Save As Template .Figure 2: Exact gene spellingFigure 1: Quantification analysisIMPORTANT : To perform further analysis with the Genvinset ® Report Viewer software, genes must be named exactly as it is specified in the software manual (Figure 2).SET UP THE EXPERIMENT FROM DESKTOP SOFTWARE1. Start the software and create a new experiment from template. Select the template previously created.2. In the Plate Setup tab add samples in the Define Targets and Samples tab. Click on Assign Targets andSamples to set up the plate.3. Select the wells and tick the box of the corresponding targets and samples.4. Go to the Run tab and click on Start Run .RESULTS ANALYSISOnce the run is finished, visualize the amplification curves in linear scale to check the correct shape of the amplification curves:- An amplification curve is considered positive if a quick and regular (exponential) increase of fluorescence values is observed (sigmoidal amplification) with Ct<35.-A weak fluorescent or background lineal or exponential signal with Ct>35 should not be considered a positive amplification.The Ct value is the cycle number at the point where the amplification curve crosses a threshold of detection. By setting a threshold line and calculating the intersection with each of the curves, the Ct value for each sample is established.When setting a threshold manually, it should be set in the exponential phase of the run, significantly above the background level to avoid noise and below the onset of the plateau phase in later cycles.Figure 3: Plate set upTo show the amplification curves, click on Analysis > Amplification Plot . The data collected during the cycling stage of PCR amplification will be displayed.PLOT CONFIGURATIONThe following settings may help in the results visualization and interpretation: •Plot settings− Plot Type : ΔRn vs. Cycle − Graph Type : Linear − Plot colour : Target• Plot Properties: Within the Amplification Plot window, click on the icon shown in Figure 5 to edit Plot Properties .•Options: In the lower side of the Amplification Plot window, the following parameters can be set:− Target : this option allows to select which target is displayed in the graph. All targets can be displayed atonce or separately.− Threshold : uncheck all the boxes, as shown in Figure 6. − Show : check only the threshold box, as shown in Figure 6.SET THE THRESHOLDFor each target gene, follow the next steps:1. Click on Analysis Settings (in the top-right corner).2. Deselect C T Settings to Use: Default Settings .3. Deselect Automatic Threshold .Figure 6: Options menuFigure 7: C T settingsFigure 4: Plot SettingsFigure 5: Plot Properties settings4. Deselect Automatic Baseline . Set 3 as the Baseline Start Cycle and 18 as the Baseline End Cycle.5. Click Apply .6. Click on Rea nalyse to reanalyse to experiment with the new settings.Once the threshold line is on display, it can be manually moved up and down to find the desired position. Adjust the threshold line above the background signal, so that it crosses close to the inflexion point of the amplification curves. The threshold line should slightly exceed the value of the highest fluorescence obtained with negative samples for the allele detected in this channel.EXPORT THE FILEThe process to obtain a file to export to the Genvinset ® Report Viewer software is the following: File > Export An Export Data window will appear. Make sure that the Results box is selected by default. If not, check it. Name the file and chose an export file location. Finally, select the (*.xls) type of file and click on Start Export .ALLELIC DISCRIMINATION (SCATTER PLOT)IMPORTANT : Genvinset ® Report Viewer software is only able to analyse experiments interpreted by amplification curves in genotyping experiments.Figure 8: Amplification plotNote 1: Before exporting the file, beware that genes should be named (exact spelling) as described in the Genvinset ® Report Viewer User’s Guide. This is important for ensuring the proper working of the Genvinset ® Report Viewer software.CREATE THE TEMPLATEThe steps to design the experiment are the following:1. Open the software and follow the next route: File > New Experiment2. In the Setup > Experiment Properties tab, select the Genotyping option, as shown in Figure 9.3. In the Setup > Plate Setup tab, edit the SNP Assay introducing the name of the experiment, the name ofeach allele to be detected and the fluorophores assigned, as shown in Figure 10. The mutated allele will be detected in the FAM channel, whereas the wild type allele will be detected in the HEX/VIC channel.4. In the Setup > Run Method tab set the amplification program.5. Last, click ok File > Save As Template .SET UP THE EXPERIMENT FROM DESKTOP SOFTWARE1. Start the software and create a new experiment from template. Select the template previously created.2. In the Plate Setup tab, add the samples to be analysed.Figure 9: Genotyping analysisFigure 10: Allele setupFigure 11: Plate set up in genotyping analysis3. Select the wells and tick the box of the corresponding SNP assays and samples.4. Go to the Run tab and click on Start Run .RESULTS ANALYSISOnce the run is finished, visualize the amplification curves in linear scale to check the correct shape of the amplification curves, as stated in the homologous section in Amplification curves analysis .SCATTER PLOTThe Allelic Discrimination Plot is displayed in Experiment Menu > Analysis for the selected SNP assay. Once you click anywhere on the graph, the data points in the plot change to the call colours. Use Plot type: Cartesian.To perform manual calls, click-drag to select the samples in the plot and select the allele call from the Apply Call drop-down list.EXPORT THE FILEOn the top-right toolbar, click File > ExportAn Export Data window will appear. Make sure that the Results box is selected by default. If not, check it. Name the file and chose an export file location. Finally, click on Start Export .Figure 12: Allelic discrimination plot。
实时定量PCR仪简明用户手册
Thermo Scientific 实时定量PCR仪PikoReal®简明用户手册目录1目录目录 (1)仪器总体介绍 (2)硬件操作和注意事项 (4)仪器安装连接 (4)仪器打包运输 (4)仪器使用注意 (5)仪器维护 (5)单机操作指南 (6)运行已有程序 (6)软件安装和操作指南 (9)软件安装 (9)连接仪器 (10)软件简介和设置 (11)新建和运行程序 (13)常见程序示例 (19)板布局 (23)结果分析和数据导出 (27)绝对定量（标准曲线）的板布局和分析 (28)相对定量的板布局和分析 (33)双探针法等位基因分型的板布局和分析 (37)高分辨率熔解曲线的板布局和分析 (41)2仪器总体介绍PikoReal 实时定量PCR仪仪器正面：上方为用户界面，下方有U盘插口和抽屉仪器背面：中间有类别标贴（REF代表仪器型号，SN代表序列号），正下方有电源线插口和网线插口用户界面：正下方有仪器名称“PikoReal 24”或“PikoReal 96”，左上角有上下并列的2个状态指示灯（上灯长时间保持蓝色——空闲待运行，上灯蓝色闪烁——程序运行中，下灯长时间保持红色——仪器出错）PikoReal和计算机通过网线相连。
如果您的计算机需要通过网线上网，可以通过USB网线转换器将计算机连接到网络；或者，您可以通过无线路由器和USB无线网卡（台式计算机需要配备，笔记本一般有内置式无线网卡，无需配备）和连接到网络USB网线转换器无线路由器PikoReal安装运行时推荐环境温度+15℃到+25℃，相对湿度不超过50%，高温和潮湿都会影响仪器的性能和实验结果。
此外，请保持入风口和出风口的气流通畅。
请勿将仪器放在热的表面或实验室桌面的纸上。
请勿将纸或其他东西弄到仪器底部，因为这会妨碍气流，甚至会被吸到仪器里面去。
出风口和其他物品或墙壁之间保持至少10厘米的距离。
请勿让其它仪器的出风口直接对着仪器请定期清理散热片此外，请勿将仪器置于灰尘多、震荡（如台式离心机周围）、强磁场、阳光直晒、穿堂风、过度潮湿或者温度波动大的地方。
实时荧光定量PCR手册
3. 延伸：在 70-72°C 之间，DNA 聚合酶的活性最佳，引 物延伸速度达每秒 100 个碱基。当实时荧光定量 PCR 中的扩增片段较小时，通常将该步骤与退火步骤合 并，温度为 60°C。
在理论上，PCR 可呈指数型扩增 DNA，使每个扩增循环 中的靶分子数倍增。在 PCR 问世之初，科学家推断，通 过与已知标准品进行比较，利用循环数和 PCR 终产物的 量可以计算出遗传物质的起始量。为达到可靠定量的要 求，实时荧光定量 PCR 技术得以问世。如今终点 PCR 主 要用于扩增特定的 DNA，用于测序、克隆及其它分子生物 学技术。
两步法 qRT-PCR
两步法定量逆转录 PCR (qRT-PCR) 的第一步是采用逆转录 酶 (RT) 将总 RNA 或 poly(A) RNA 逆转录为 cDNA。采用 随机引物、oligo(dT) 或基因特异性引物 (GSP) 完成第一链 cDNA 合成反应。为在实时荧光定量 PCR 应用中平均表示 所有靶点并避免 oligo(dT) 引物的 3’ 偏差，许多研究人员 采用了随机引物或 oligo(dT) 和随机引物的混合物。
cDNA 合成采用的温度取决于所选的 RT 酶。逆转录完成 后，将约 10% 的 cDNA 转移至单独的管中，完成实时荧光 定量 PCR 反应。
一步法 qRT-PCR
一步法 qRT-PCR 可在同一管内完成第一链 cDNA 合成反 应和实时荧光定量 PCR 反应，简化了反应设置，并降低 了污染的可能性。需要使用基因特异性引物 (GSP)。这是 由于在一步法操作中使用 oligo(dT) 或随机引物将生成非特 异性产物，降低了目的产物的量。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
实时荧光定量PCR (2)
PCR方法：
每管加入DDW 8.5ul反转录产物2ul，引物各1ul，2XTaq Mix 12.5ul，每管中加入10ul石蜡油，放入PCR仪。运行 程序94℃变性3分钟，然后进入循环；94℃ 30秒，50℃ 30 秒；72℃ 1分钟，共30个循环。
植物病毒的RT-PCR试验 四、注意事项：
反转录： 1.操作者要戴口罩； 2. 尽量避免空气流动； 3.快速操作，避免造成RNA降解。 PCR： 1.加样要准确，不同试剂要换枪头，避免污染； 2.退火温度要根据引物的退火温度设定，变性以 及延伸时间，要根据片段大小确定； 3.反应结束时，最后一步设置10℃ forever；
植物病毒RNA的提取试验 四、注意事项：
1．前两步中不要剧烈震荡：氯仿对蛋白有变性作用，剧烈的 震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触，从而使 DNA污染RNA； 2．RNA提取的操作过程要在冰上进行； 3. 操作者要戴口罩； 4. 尽量避免空气流动。 5. 提取用所有枪头与离心管都要进行无RNA酶处理。
时即可用于蚜虫繁殖。 b.无毒蚜虫繁殖：将无毒蚜虫用毛笔转接到已准备好的生长 旺盛的健康小麦上，平均每株小麦转接5-15头。转接后将小麦 置于20℃饲毒72h，使其充分带毒。
大麦黄矮病毒的蚜虫传毒试验
三、实验方法：
3.传毒 将带毒蚜虫用毛笔转接到长至两叶期的健康小麦上取食，然
植物病毒的RT-PCR试验 三、仪器和试剂：
水浴锅或金属浴、PCR仪、小型低速离心机等。 反转录酶、dNTPs、引物、DEPC处理水等。
植物病毒的RT-PCR试验 四、实验方法：
反转录方法：
1. 取2 µ L 病毒RNA溶液，分别加入0.5 µ L 下游引物，2.5 µ L DEPC处理水，充分混匀。 2. 70℃处理5min，冰置5min。 3. 加入2 .5µ L 5X M-MLV buffer，1.75 µ L DEPC处理水，2 .5µ L 10 mM dNTPs ，加入0.25 µ L RNase，0.5µ L M-MLV 酶。 4. 42℃反应1h，70℃ 5min，即得cDNA。
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
Archimed Analyzer 荧光定量PCR系统 简明操作手册—非洲猪瘟检测说明书
Archimed实时荧光定量PCR系统Archimed Analyzer（Software Version1.08）简明操作手册非洲猪瘟检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司利用Archimed荧光定量PCR仪完成一个非洲猪瘟检测实验共分8个步骤，如下图所示操作流程图：1.启动系统1.1启动电脑显示器、主机；1.2打开仪器后底板的电源开关，电源状态灯POW为蓝色，常亮；1.3等待系统自检，自检过程中状态灯STU为绿色闪烁状态，自检通过后为绿色常亮；1.4双击桌面软件图标，启动软件；1.5软件启动中界面；1.6软件启动完成后界面；2.创建实验2.1点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；2.2点击菜单栏的“从模板创建”，可以通过之前已保存的实验运行模板创建新实验。
3.设置实验属性点击页面左侧的实验属性选项，进入实验属性设置界面：3.1实验名称：系统默认以实验当前的时间而命名，也可以自己命名，但目前不支持中文和特殊字符，这里以系统默认名称命名；3.2仪器型号：根据实际使用机型进行选择，这里以选择Archimed-X6系统为例；3.3反应管类型：根据实际使用的反应管类型进行选择，这里以选择白管为例；3.4实验类型：选择绝对定量和相对定量（ΔΔCt）都可以，但是不能选择熔解曲线，我们这里选择绝对定量。
3.5实验试剂：根据实际使用的试剂类型进行选择，非洲猪瘟检测试剂盒多采用TaqMan试剂，所以这里以Taqman试剂为例进行说明。
4.设置运行条件实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面：4.1反应体积设置：建议在5-25ul，实际实验可在1-30间选择一个值，明日达和郑州中道都选择25ul体系，反应体系后面显示热盖温度为100°C；4.2反应阶段设置：根据实际使用的试剂说明书设置反应阶段及步骤，如需增加或减少PCR反应阶段，如“保温”、“PCR反应”等，可将鼠标移至反应阶段区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此阶段前或后增加一个阶段，中间“-”代表去掉此阶段；如需增加或减少PCR某阶段中的反应步骤，可将鼠标移至该步骤区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此步骤前或后增加一个步骤，中间“-”代表去掉此步骤；4.3反应温度设置：时间、温度、升温速度（熔解曲线模式）的设定可以通过在数值区输入数值或点击进行，其中温度的设置还可通过点击拖拽温度曲线中的进行温度更改，拖动时温度以1°C为单位发生改变；注意：时间设置最小值不能小于00:01秒，进行实际更改时请避免4.4信号采集的相机图标：在每个反应步骤的时间框下面都有一个信号采集的相机图标，相机图标有两种状态，当为深蓝色时，代表处于信号采集开启状态，当为浅蓝色时，代表处于信号采集关闭状态，软件默认在每个循环扩增完成后进行信号采集；根据4.1到4.4的设置方法设置好后，明日达试剂盒运行条件如下图所示：根据4.1到4.4的设置方法设置好后，郑州中道试剂盒运行条件如下图所示：4.5运行条件模板保存：设置好的运行条件，可以点击界面左上角的保存按钮后的下拉菜单，单击另存为，即会弹出保存对话框。
实时荧光定量PCR操作指南
实时荧光定量PCR操作指南实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、病毒检测、疾病诊断等领域。
本文将为您提供一份详细的实时荧光定量PCR操作指南，以帮助您正确高效地进行实验。
一、前期准备1.仪器准备确保实时荧光定量PCR仪的工作状态正常，能够提供稳定的温控和荧光检测功能。
2.试剂准备准备好使用的引物和探针、反转录酶、核酸模板、PCR酶、荧光探针等试剂，并按照相关说明进行稀释和储存。
3.实验室操作保持实验室环境清洁整洁，确保试剂和样品不受外界污染。
佩戴实验手套和口罩，避免DNA污染。
二、PCR体系设置根据您的实验目的和试剂系统的要求，设置PCR反应的体积和组分。
1.配置PCR体系a.将反向转录试剂盒中的试剂按照说明书中的比例进行配置，包括引物、探针、反转录酶、核酸模板等。
b.添加核酸模板到体系中，确保模板的质量和浓度适合实验要求。
c.添加合适的PCR酶，如Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶等。
d.添加稀释的胶原酶。
2.装管设置a.在无菌条件下，将PCR反应体系分装至PCR管中。
b.避免气泡的产生，确保体系均匀混合。
三、PCR参数设置根据实验需求和试剂系统的建议，设置PCR反应的温度和时间参数。
1.反转录步骤a.按照试剂盒说明书的建议，设置反转录温度和时间。
常见的反转录参数为42℃，60分钟。
2.PCR扩增步骤a.设置初始变性温度和时间。
常见的初始变性参数为95℃，5分钟。
b.设置PCR循环数和每个循环的温度和时间。
常见的PCR循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环。
c.设置荧光检测温度和时间。
根据荧光探针的特性，设置合适的温度和时间窗口。
四、数据分析和结果解读1.数据采集实时荧光定量PCR仪会自动记录荧光信号和温度变化数据，确保您保存这些数据供后续分析和结果解读使用。
实时荧光定量PCR仪使用说明书
实时荧光定量PCR仪使用说明书一、引言实时荧光定量PCR仪是一种高精度的分子生物学实验仪器，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传多态性分析等领域。
本说明书将介绍实时荧光定量PCR仪的基本操作流程、主要功能模块及相关注意事项。
二、仪器概述实时荧光定量PCR仪由以下组成部分构成：1. 仪器外观：实时荧光定量PCR仪外形美观大方，采用高质量塑料和金属材料制成，确保仪器的稳定性和耐用性。
2. 基本功能模块：实时荧光定量PCR仪包含恒温控制系统、光学采集系统和数据处理系统等主要模块。
(1) 恒温控制系统：实时荧光定量PCR仪可精确控制反应体系的温度，支持高速升温和快速降温，同时提供恒温状况下的稳定控制。
(2) 光学采集系统：实时荧光定量PCR仪配备高灵敏度的光学传感器，可实现对荧光信号的准确采集。
(3) 数据处理系统：实时荧光定量PCR仪可实时监测和记录PCR反应的信号强度，并通过内置算法对数据进行分析和处理。
三、操作流程实时荧光定量PCR仪的操作流程如下：1. 准备样本和试剂：根据实验需要，准备好待检测的样本溶液和PCR试剂。
2. 设置反应条件：按照实验方案要求，在仪器上设置好所需的反应条件，包括温度、时间和循环次数等参数。
3. 导入样本：使用专用导入工具，将样本溶液小心地加入PCR反应管或板中，并确保导入的样本量准确。
4. 启动仪器：按下仪器上的启动按钮，开始PCR反应过程。
5. 反应监测：实时荧光定量PCR仪会自动监测荧光信号的变化，并将数据实时显示在仪器屏幕上。
6. 数据分析：在PCR反应结束后，使用仪器自带的数据处理软件对监测到的荧光信号进行分析，根据实验需要得出结果。
四、注意事项使用实时荧光定量PCR仪时需要注意以下事项：1. 按照仪器说明书准确操作：在使用实时荧光定量PCR仪之前，仔细阅读使用说明书，并按照说明书上的操作步骤进行操作。
2. 仪器检查和维护：定期检查仪器的温度控制系统和光学采集系统，确保其正常工作。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。
严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
Bio-Rad定量PCR说明书.ppt
Introduction to Quantitative PCR
PCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记
定量PCR仪应该具备的特点：杰出的温度控制
• 采用半导体加热和制冷 • 加热速度 3.3°C /秒 ，制冷速度
2°C/秒 • 升降温速度可调 • 控温准确性：±0.3℃
定量PCR仪应该具备的特点：梯度PCR功能
采用多点温控和传 感技术，可以实现 梯度PCR功能
温度梯度选择可以 允许使用者在同一 次扩增中优化复性 温度。
定量PCR仪应该具备的特点： 消耗品成本低，样品容量大
同时扩增和检测96个样品
采用0.2ml的离心管, 排管和 96 孔PCR反应板。 降低消耗品成 本。
Introduction to Quantitative PCR
•无法对扩增反应实时检测
PCR: Theory vs. Reality
• C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.
End Point
Cycle
Real-Time PCR
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓 度进行定量的方法。
Quantitative PCR /Real time PCR
▪ Quantitative PCR 或 Real time PCR 是确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝 数最敏感、最准确的方法
PCR: Theory vs Reality
CFX 系列实时荧光定量 PCR 仪说明书
CFX 系列实时荧光定量 PCR触摸屏可让您无需电脑即可并在实验过程中实时浏览独特的离线操作模式 使之成为真正无需外接电脑控制的定量 PCR 仪的设计理念 每台仪器的光学系统出厂时都经过校正 安装使用过程中也反应模块设计实现超大大缩短运行时间配的温度梯度功能是帮助您筛选最佳反应条件的有力工具 节省通道多重5 µl 也能得CFX384 Touch反应也能得到理想运行结束后实验结果可作为您更多信息 请浏览 /qpcrsystems2.5˚C/sPeltier0–100˚C±0.2˚C90˚C 10秒达到LEDsFiltersFilters Photodiodes通过彩色 LCD触摸屏完成仪器操控和运行状态实时监控CFX96 Touch Deep Well ™ 定量 PCR 仪1020 3040CFX Connect ™ 定量 PCR 仪及双通道检测器320 10 20 30 40500 10 20 30 40 50432320 10 20 30 40500 10 20 30 40 50302520151034 5 6 7 8 90 10 20 30 40 50432010203040502345010203040502345人性化的界面 高效简洁的设置向导■ CFX Manager Software 3.0 提供了多种相对定量的分析方法供您选择 包括 法 法 多内参校正法 结Gene Study 无限量数据合并分析■ CFX Manager 能与 LIMS 系统兼容 并符合美国 FDA 21 之要求伯乐生命医学产品 上海 有限公司地址 上海市浦东东方路 18 号保利广场 E 栋 3 楼电话 021 - 6169 8500传真 021 - 6169 8599邮编 200120北京办事处地址 北京朝阳区曙光西里 5 号A 栋凤凰置地广场 22 楼电话 010 - 5939 0088传真 010 - 5939 0160邮编 100028广州办事处地址 广州市环市东路 403 号广州国际电子大厦 1302 - 03 室电话 020 - 8732 2339传真 020 - 8732 2332邮编 510095中国呼叫中心 800 - 820 - 5567 ************欢迎访问 Ordering Information Catalog # Description184-5384 CFX 384™ Optical Reaction Module, for use withC1000 Touch thermal cycler chassis, includes CFXManager software, license for qbase PLUS software,communication cable, reagents, consumables185-5484 CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System,includes C1000 Touch thermal cycler chassis,CFX384 optical reaction module, CFX Managersoftware, license for qbase PLUS software,communication cable, reagents, consumables184-5096 CFX96™ Optical Reaction Module, for use withC1000 Touch thermal cycler chassis, includes CFXManager software, license for qbase PLUS software,communication cable, reagents, consumables185-5196 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System,includes C1000 Touch thermal cycler chassis,CFX96 optical reaction module, CFX Managersoftware, license for qbase PLUS software,communication cable, reagents, consumables184-5001 CFX Manager Software, Security Edition, includes 1user license, installation CD, HASP HL key184-5025 Precision Melt Analysis Software, includes 2 userlicenses, installation CD, 2 HASP HL keys, meltcalibration kit184-5008 CFX Manager Software, Chinese Edition, includes3user licenses, installation CD, 3 HASP HL keys185-4096 CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR DetectionSystem, includes C1000 Touch thermal cyclerchassis, CFX96 Deep Well™ optical reactionmodule, CFX Manager software, license forqbase PLUS software, communication cable,reagents, consumables185-4095 CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR DetectionSystem, includes C1000 Touch thermal cyclerchassis, CFX96 Deep Well optical reaction module,CFX Manager software, license for qbase PLUSsoftware, communication cable184-4096 CFX96 Deep Well Optical Reaction Module, for use with C1000 Touch thermal cycler chassis, includesCFX Manager software, license for qbase PLUSsoftware, communication cable, reagents,consumables185-5200 CFX Connect Real-Time PCR Detection System,includes CFX Connect thermal cycler chassis, CFXConnect optical reaction module, CFX Managersoftware, license for qbase PLUS software,communication cable, reagents, consumables 185-5201 CFX Connect Real-Time PCR Detection System,includes CFX Connect thermal cycler chassis, CFXConnect optical reaction module, CFX Managersoftware, license for qbase PLUS software,communication cable184-5008 CFX Manager Software, Chinese Edition, includes 3user licenses, installation CD, 3 HASP HL keys184-5025 Precision Melt Analysis Software, includes 2 userlicenses, installation CD, 2 HASP HL keys, meltcalibration kit172-5200 SsoFast™ EvaGreen® Supermi x 2 ml, 2x real-timePCR mix, contains dNTPs, Sso7d fusion polymerase,MgCl2, EvaGreen dye, stabilizers, for 200 x 20 μlreactions172-5210 SsoFast™ EvaGreen® Supermix with Low ROX 2ml, 2x real-time PCR mix, contains dNTPs, Sso7dfusion polymerase, MgCl2, ROX passive referencedye, stabilizers, for 200 x 20 μl reactions172-5120 iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix 2 ml (2 x1ml), 2 x qPCR mix, contains dNTPs, iTaq DNApolymerase, MgCl2, SYBR® Green I, enhancers,stabilizers, fluorescein, ROX normalization dyes, for200 x 20 μl reactions172-5130 iTaq™ Universal Probes Supermix 2 ml (2 x 1 ml),2 x qPCR mix, contains dNTPs, iTaq DNApolymerase, MgCl2, enhancers, stabilizers, ROXnormalization dyes, for 200 x 20 μl reactions172-5270 SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix 2ml (2 x 1ml), contains dNTPs, Sso7d fusionpolymerase, MgCl2, SYBR® Green I, enhancers,stabilizers, fluorescein, ROX normalization dyes, for200 x 20 μl reactions172-5280 SsoAdvanced Universal Probes Supermix 2 ml (2 x1 ml), contains dNTPs, Sso7d fusion polymerase,MgCl2, enhancers, stabilizers, ROX normalizationdyes, for 200 x 20 μl reactions172-5996 SsoFast EvaGreen Control Assay, predesigned kitfor verifying performance of real-time PCR systemsor training new users, includes template DNA,primers, supermix, waterHSP-9601 Hard-Shell® Thin-Wall 96-Well Skirted PCR Plates,white shell, clear well, 50MSB-1001 Microseal® 'B' Adhesive Seals, optically clear, 100China/Printed in China13-121 0613。
7300&7500 实时定量 PCR 仪阴性阳性实验中文说明书
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目录
阳性 / 阴性实验 工作流程 前言
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如何使用本指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii 如何获取更多信息 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .viii 如何获取服务与支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii 将您的意见和建议发送给我们 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Part Number 4347965 Rev. B 3/2004
ii
7300/7500 实时定量 PCR 仪阳性 / 阴性实验入门指南
3 18, 2004 10:47 …œŒÁ, PlusMinus_FrontCover.fm
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实时荧光定量 PCR 仪快速操作指南说明书
实时荧光定量PCR仪快速操作指南1.连接电源从包装箱里取出仪器放置在实验台上，拿出电源线和电源适配器，将电源线一端与电源适配器相连，另一端连接至交流220V电源插座（AC85~264V）电源适配器的输出端连接到仪器电源插孔。
接口插入仪器电源插孔，注意插孔方向箭头方向朝上。
打开仪器背面的电源开关开启仪器，仪器自检成功，自动进入到软件界面。
2.样品准备◼准备试剂Q1600实时荧光定量PCR仪使用0.2ml透明离心试管根据试剂要求选用10-100μl合适的加液量。
◼离心操作配置完成试剂样本的试管在放入仪器之前，要用离心机进行离心操作，确保试剂液体处于试管底部，且液体内部不含有气泡。
◼放置样品将反应管按照顺序放入加热孔内。
3.设置程序，运行实验软件操作基本步骤：◼新建实验新建实验，选择运行槽◼基本设置设置实验名称，实验类型，检测项目，选择使用的染料。
◼样本设置设置样品名称，样本ID号，选择样本类型◼程序设置设置需要的反应程序◼保存文件单击保存，保存实验文件◼运行单击运行，运行实验。
4.结果分析◼实验结束，软件自动计算Ct值，根据判定规则自动出结果。
◼如需进行熔解分析和基因分型，在软件分析类型里选择相应的分析功能。
5.结果导出◼导出实验结果单击导出，导出实验数据。
◼结果打印连接配置的热敏打印机，选中要打印的样品孔，单击打印，打印实验结果。
6.关闭仪器◼实验结束，取出反应管◼长按仪器前面板关机按键，关闭仪器◼长时间不使用仪器，请关闭仪器背部左下角电源开关。
实时定量PCR仪简明用户手册
Thermo Scientific 实时定量PCR仪PikoReal®简明用户手册目录1目录目录 (1)仪器总体介绍 (2)硬件操作和注意事项 (4)仪器安装连接 (4)仪器打包运输 (4)仪器使用注意 (5)仪器维护 (5)单机操作指南 (6)运行已有程序 (6)软件安装和操作指南 (9)软件安装 (9)连接仪器 (10)软件简介和设置 (11)新建和运行程序 (13)常见程序示例 (19)板布局 (23)结果分析和数据导出 (27)绝对定量（标准曲线）的板布局和分析 (28)相对定量的板布局和分析 (33)双探针法等位基因分型的板布局和分析 (37)高分辨率熔解曲线的板布局和分析 (41)2仪器总体介绍PikoReal 实时定量PCR仪仪器正面：上方为用户界面，下方有U盘插口和抽屉仪器背面：中间有类别标贴（REF代表仪器型号，SN代表序列号），正下方有电源线插口和网线插口用户界面：正下方有仪器名称“PikoReal 24”或“PikoReal 96”，左上角有上下并列的2个状态指示灯（上灯长时间保持蓝色——空闲待运行，上灯蓝色闪烁——程序运行中，下灯长时间保持红色——仪器出错）PikoReal和计算机通过网线相连。
如果您的计算机需要通过网线上网，可以通过USB网线转换器将计算机连接到网络；或者，您可以通过无线路由器和USB无线网卡（台式计算机需要配备，笔记本一般有内置式无线网卡，无需配备）和连接到网络USB网线转换器无线路由器PikoReal安装运行时推荐环境温度+15℃到+25℃，相对湿度不超过50%，高温和潮湿都会影响仪器的性能和实验结果。
此外，请保持入风口和出风口的气流通畅。
请勿将仪器放在热的表面或实验室桌面的纸上。
请勿将纸或其他东西弄到仪器底部，因为这会妨碍气流，甚至会被吸到仪器里面去。
出风口和其他物品或墙壁之间保持至少10厘米的距离。
请勿让其它仪器的出风口直接对着仪器请定期清理散热片此外，请勿将仪器置于灰尘多、震荡（如台式离心机周围）、强磁场、阳光直晒、穿堂风、过度潮湿或者温度波动大的地方。
LightCycler 480II 实时荧光定量PCR仪 说明书
LightCycler® 480 II 实时荧光定量PCR仪非凡体验谋求突破，专业设计诠释经典LightCycler ® 480 II 实时荧光定量PCR 仪具备出色的分辨率、重复性及高速度，可广泛应用于科研、临床诊断、食品安全、疫情监控等1985 Kary Mullis 发明PCR 技术▼▲*1991 罗氏公司获得PCR全球专利权▲1993 Kary Mullis 因发明PCR 技术而获得诺贝尔化学奖▲1998 罗氏应用科学部推出LightCycler ®全自动实时定量PCR 仪▲2012 含新光源的LightCycler ®480 II 上市▲2006 LightCycler ® 480全自动实时定量PCR 仪问世！1993 罗氏公司Russell Higuchi 发明实时定量PCR 仪▼1995 罗氏诊断公司推出PCR 诊断行业金标准：COBAS Amplicor▼2008 全新升级型号，LightCycler ® 480 II 正式上市▼2005 LightCycler ®全球装机突破5000台，成为全球销量成绩斐然的单型号实时定量PCR 仪▼高精密度轻松区分1.5倍浓度差异，置信度≥99.8%高灵敏度可检测单拷贝基因动力学范围广可同时检测到1-1010个拷贝DNA 高重复性重复性高，CV ＜0.15%高速40分钟完成40个PCR 循环(384孔板)技术领先采用Therma-Base TM热循环技术(专利号US Patent No.5161609)、导热性能好的银质热循环模块和先进的光学检测系统，彻底消除边缘效应，保持稳定优质的检测结果，且整个过程中无需使用ROX 等内参染料，有效节约成本全能分析模式多样，绝对定量、相对定量、基因分型(熔解曲线法及终点法)、高分辨率熔解曲线分析，同时适用市面上主流的检测模式(染料检测、水解探针(TaqMan ®探针)、杂交探针、简单探针等)开放式平台可使用市面上绝大多数常见荧光染料以及第三方提供的8联管、96孔板和384孔板灵活可互换的96孔、384孔加热模块，用户可自行更换，无需工程师到场自动化平台配以LIMS 系统及自动进样机械臂，可实现远程操作及全自动化运行LightCycler ® 480 II 实时荧光定量PCR 仪——温控系统独具匠心的PCR热循环模块设计加热模块和冷却元件之间引入的高效热平衡技术(Therma-Base TM)，同时使用导热性能出色的银质材质，使LightCycler ® 480 II 的温控系统获得了技术性的进步。
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COMPONENTS of Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)
™
Maxima™ Hot Start Taq DNA Polymerase is a Taq DNA polymerase which has been chemically modified by the addition of heat-labile blocking groups to amino acid residues. The enzyme is inactive at room temperature, avoiding extension of non-specifically annealed primers or primer dimers and providing higher specificity of DNA amplification. The enzyme provides the convenience of reaction set up at room temperature. Maxima™ SYBR Green qPCR Buffer has been specifically optimized for qPCR analysis using SYBR® Green I. It contains both KCl and (NH4)2SO4 to provide high specificity of primer annealing. The buffer composition allows for PCR at a wide range of MgCl2 concentrations. Therefore, optimization of MgCl2 concentration in PCR is generally not necessary. SYBR® Green I is a fluorescent intercalating dye which binds to the double stranded DNA and emits a fluorescent signal upon binding. In qPCR, DNA accumulates and fluorescent signal increases proportionally to the DNA concentration. The excitation and emission maxima of SYBR® Green I are at 494 nm and 521 nm, respectively, which are compatible with the use on any real-time cycler. ROX Passive reference dye is included in the master mix to serve as an internal reference for normalization of the SYBR® Green I fluorescent signal when using machines which can detect ROX, e.g. Applied Biosystems. Rox allows for correction of wellto-well variation due to pipetting inaccuracies and fluorescence
DESCRIPTION
The Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) is a ready-to-use solution optimized for quantitative real-time PCR and two-step real-time RT-PCR. The master mix includes Maxima™ Hot Start Taq DNA polymerase and dNTPs in an optimized PCR buffer. It contains SYBR® Green I dye and is supplemented with ROX passive reference dye. Only template and primers need to be added. Maxima™ Hot Start Taq DNA polymerase in combination with an optimized buffer ensures PCR specificity and sensitivity. The SYBR® Green I intercalating dye allows for DNA detection and analysis without using sequence-specific probes. dUTP is included in the mix for optional carryover contamination control using uracil DNA glycosylase (UDG). The use of Maxima™ SYBR® Green/ROX qPCR Master Mix in real time PCR ensures reproducible, sensitive and specific quantification of genomic, plasmid, viral and cDNA templates. The master mix can be used with real-time thermal cyclers, that are compatible with ROX reference dye; Applied Biosystems, ABI PRISM® 7000, 7300, 7900 HT, StepOne™.
Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)
TABLE O......................................................................... 2 DESCRIPTION........................................................................................ 2 COMPONENTS of Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)........ 3 GUIDELINES TO ASSAY DESIGN............................................................... 4 Templates. ..................................................................................... 4 Primers......................................................................................... 5 Necessary controls......................................................................... 6 IMPORTANT NOTES. ............................................................................... 6 PROTOCOL . ......................................................................................... 7 Reaction set-up............................................................................. 7 Thermal cycling conditions............................................................. 8 TROUBLESHOOTING. ............................................................................ 11 QUALITY CONTROL.............................................................................. 14 RELATED PRODUCTS........................................................................... 14
Note. UDG is not included in the Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix and must be purchased separately.
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Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)
Component
Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) Water, nuclease-free
#K0221 (for 200 rxns of 25 µl)
2 x 1.25 ml 2 x 1.25 ml
#K0222 (for 1000 rxns of 25 µl)
10 x 1.25 ml 10 x 1.25 ml
#K0223 (for 4000 rxns of 25 µl)
4 x 12.5 ml 2 x 30 ml