琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物演示课件

是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间， 在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般 >5ng。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：
1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观 察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。
２.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与 DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠 正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量 较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是： 将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。
12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中， 放于4℃保存，以备下实验用。
PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1%的 琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750Байду номын сангаасp，500bp，250bp，100bp。
３.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2） 比正极气泡（O2）多一倍。
复习思考题
问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实 验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察， 可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小 决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质 量的对数成反比。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
（三） 试剂
1.琼脂糖
2. TAE电泳缓冲液(50×) （pH8.0）
Tris
242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml
3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕 色瓶或铝铂纸包装保存。
4. 10×DNA样品上样缓冲液
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳
孔中。
SUCCESS
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2019/6/26
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽 中负极的铂金丝是否有气泡出现。
11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电 流）回零，关闭电源，停止电泳。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法
实验原理
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳和聚 丙烯酰胺电泳。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染 环境。
实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样 品不能污染。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机
（二） 材料 实验一中的PCR产物
6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝 固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将 凝胶放入电泳槽中。
7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中， 使液面高于胶面约1mm。
8.在DNA样品中加入2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍 甩一下，使溶液都处于离心管底。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据 DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子 量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时， 溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭 分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA 在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足 够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量， 这样就可以检测DNA的浓度。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
实验步骤：琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制
胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入 40ml电泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓度为0.5 g/ml)，轻轻摇匀，倒入制胶 槽上，检查有无气泡。
关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法 几点注意事项：
1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带 型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的 溶液，以赶走样品空中的气泡。
2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大 小、数目及样品孔形状与容量。
3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以 免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影 响结果分析。