蛋白质的结构和功能

以质谱仪测定蛋白序列
Sample
+ _
Ionizer
Mass Filter
Detector
质谱仪是利用分子的质量大小来检定样本，因此可以精确测出某分子 的质量。若把蛋白质在质谱仪中与氮气撞击，产生一群具有各种不同 长短的片段，然后用质谱仪一一测出这些片段的分子量，由所得各种 片段分子量的差别，就可推出相差氨基酸的种类，乃至整段氨基酸的 序列。
二级结构 (secondary structure)
三级结构 (tertiary structure)
空间结构 空间构象
四级结构 (quaternary structure)
序列决定结构，结构决定功能
（一）蛋白质分子的一级结构
1.蛋白质一级结构的概念
多肽链上各种氨基酸从N端到C端的排列顺序
胰岛素一级结构 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。
3.蛋白质二级结构的主要形式
• -螺旋 ( -helix ) • -折叠 ( -pleated sheet ) • -转角 ( -turn ) • 无规卷曲 ( random coil )
➢-螺旋 ( -helix )，由主链氢键网络稳定的具有多面性的柱状结构
螺旋 偶极
螺旋帽:N末端氨基酸残基未饱
Φ
φ
phi
fai
Ψ
ψ
psi psai
扭转角：一个可旋转化学键两侧 两个基团间所成的角度。 Φ扭转角：N-Cα键与相邻肽键形 成的夹角 Ψ扭转角：Cα-C键与相邻肽键形 成的夹角 从肽链N端看，顺时针方向为正， 逆时针方向为负
和均为零 时的构象， 由于相邻肽 平面的H原 子和O原子 之间在空间 上重叠，此 构象实际上 并不允许存 在。和同 时旋转1800， 则转变为完 全伸展的肽 链构象(前 页)。
质谱法
Edman循环后看分子 量的变化
(2) 由cDNA序列确定蛋白序列
DNA上的碱基序列与它 所编码蛋白质的氨基酸 顺序呈线性相关
分离纯化蛋白质
酶切部分水解后分离短肽
对短肽进行测序
构建cDNA文库
根据序列设计探针
筛选cDNA文库
根据cDNA序列推测蛋白质的一级结构
蛋白质序列数据库 ncbi.nlm.org
5、分离水解后得到的多肽 Peptide separation
6、测序
Sequencing
7、重叠
Overlapping
8、二硫键位置的确定 Disulfide bond po.
N端的测定方法
1、Sanger法 2、Edman法 3、Dansyl chloride/Edman法 4、酶降解法
Edman 降解法(I)
Insulin protein sequence
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化 Purification
2、二硫键的拆分与保护 S-S cleavage
& blocking
3、(亚基分离） separation
Subunit
4、多种方法的部分水解 Partial hydrolysis
（二）蛋白质的基本结构单位——氨基酸 1、结构通式
COOH
H2N
Cα
H
R
L- α-Amino Acid
蛋白质氨基酸均为L型，D型多存在于细菌产生的抗菌素 或植物的生物碱中
2、氨基酸的分类
按照R基的性质分类
➢非极性、脂肪族R基氨基酸
G
A
V
通常位于蛋白的 内部
L
M
I
P 亚氨基酸
➢芳香族R基氨基酸
F 内部
Y W
表面/内部
➢不带电荷的极性R基氨基酸
S T
G
Leabharlann Baidu
N
内部
C 主要存在于蛋白 的外部
Q
➢带正电荷的R基氨基酸（碱性氨基酸）
通常位于蛋白外 部，有时位于内 部，与带负电荷 的氨基酸形成盐 键
K
H
R
➢带负电荷的R基氨基酸（酸性氨基酸）
通常位于蛋白外 部，有时位于内 部，与带正电荷 的氨基酸形成盐 键
的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸 （Hyl）。
非生蛋白氨基酸： 蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同
型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。
3、氨基酸的理化性质
➢两性解离及等电点
酸性羧基 碱性亚氨基
等电点：在某一pH的 溶液中，氨基酸解离成 阳离子和阴离子的趋势 及程度相等，成为兼性 离子，呈电中性，此时 溶液的pH质称为该氨 基酸的等电点 （isoelectric point, pI）。等电点时氨基酸 既不向阳极也不向阴极 移动。
稳定折叠蛋白的化学键
除氨基酸之间连接的肽键和二硫键两个共价键外， 折叠蛋白质的其他稳定能则来自于共价键之外的非共价 弱极性相互作用，主要包括盐桥、氢键、范德华力和长 距离静电相互作用。
➢范德华力（van der Waals force）：当一个原子或
成键的几个原子上电子云的变化诱导邻近的非成键原子产生 相反的变化的偶极时，就产生非常弱的静电吸引，即为范德 华力，对维持活性中心的构象尤为重要。疏水性侧链范德华 力最大
DABITC: 4-N,N-二甲氨基偶氮 苯－4'－乙内酰硫脲
pH 9
CF3COOH/无水
DABITC：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman 降解法(II)
无冕英雄 Pehr Victor Edman
• 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19
• 1946-47年在美国留学时想到改进1930 年Abderhalden & Brockmann发明的 PITC试剂的反应, 50年发明Edman degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950)
➢紫外吸收
色氨酸、酪氨酸、苯 丙氨酸等含共轭双键氨基 酸的最大吸收峰在 280
nm 附近。
大多数蛋白质含有这 几种氨基酸残基，所以测 定蛋白质溶液280nm的光 吸收值是分析溶液中蛋白 质含量的快速简便的方法。
芳香族氨基酸的紫外吸收
3、氨基酸的化学反应
用途：常用于氨基酸的定性或定量分析；用来鉴定 多肽或蛋白质NH2末端氨基酸；用于修饰蛋白质。
D
E
按照疏水性分类
➢疏水性氨基酸
仅参与范德华力相互作用，疏水作用的基础。多出现在 螺旋中，脯氨酸除外（主链碳原子与自身R基形成氢 键。）
➢亲水性氨基酸 可以与主链、极性有机分子和水分子形成氢键。
➢两亲性氨基酸 同时具有极性和非极性，是理想的界面分子。
特殊氨基酸
修饰氨基酸： 蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应
➢疏水作用（Hydrophobic effect)
在水中的非极性基团相互作用 以尽量减少同极性溶剂接触表面 积的趋势，称为疏水作用。
非极性基团相互聚集，位于多 肽链的内部，极性基团位于表面， 与水形成氢键，而聚集在内部的 多肽链主链分子不能与水形成氢 键，只能相互间形成氢键，导致 多肽链折叠更加紧密，结构更加 稳定。
白、PDZ结构域蛋白等。
特定模体或结构域常与某种生物学功能相关联， 根据结构与功能的关系，将具有相同或类似模体或 者结构域的蛋白质归为一大类，一类或一组，分别 称为超家族（super family）、家族（family） 或亚家族（subfamily）。
三、蛋白质的结构
一级结构 (primary structure) 初级结构
尿素，盐酸胍
（guanidine hydrochloridHe2NC(:NH)NH2 HCl ）
疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂
Van der Waals力：稳定紧密堆积的基团和原子
离子键：稳定α-螺旋，三、四级结构 酸、碱
二硫键：稳定三、四级结构
还原剂
配位键：与金属离子的结合
螯合剂 EDTA
（二）蛋白质分子的二级结构
1.蛋白质二级结构的概念 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，
也就是该肽链主链骨架原子相对空间位置，并 不涉及氨基酸残基侧链的构象
稳定因素：氢键
➢肽平面
肽单元
O R
•参与肽键的6个原子C1、C、 N
C
O、N、H、C2位于同一平面，
Cα ψ
C1和C2在平面上所处的位置
R
谷胱甘肽(glutathione, GSH)
4.蛋白质一级结构的测定
(1) 传统氨基酸测序法
1955年Frederick Sanger测出胰岛素 （insulin）的一级结构，获得1958年诺贝尔 化学奖。方法：先将胰岛素多肽链切成小段， 以化学方法定出小段序列后，由各小段重叠的 部分将原序列重组出来。
O 盐桥 H
C-
O
N+ H
H
与氢原子共价连接的原子称为供体原子，未共价连接的原 子称为受体原子。当受体和供体都完全带有电荷时，键能
显著提高，这时形成氢键的离子对称为盐桥。
水形成氢键的特性对于蛋白质结构具有重要的影响
受体
受体
供体
蛋白质结构中几乎所有潜在的氢键供体和受体都参与蛋白 质自身极性基团或与水分子间的氢键作用。最普遍的氢键 基团是C=O和N-H，在蛋白质内部这些基团不能与水形 成氢键，倾向于彼此间形成氢键，结果构成了稳定蛋白质 折叠状态的二级结构。
2.肽键和二硫键
一个氨基酸分子中的氨基与 另一个氨基酸分子中的羧基脱水 缩合形成的酰胺键称为肽键。
两个氨基酸通过肽键连接形 成最简单的肽，二肽。10个以 内，寡肽（oligopeptide）,10 以上称为多肽，多肽链。
多肽链中氨基酸分子因为脱 水缩合而稍有残缺，称之为氨基 酸残基（residue）。
和均为1800，为完全伸展的肽链构象。
左手 螺旋
原子和原子团物理大小限制了φ和ψ转角的大小，根据允 许的φ和ψ值可以做出Ramachandran图。红色：不会引起 空间位阻的转角组合；粉色：空间位阻发生一定程度的张 弛时的转角组合
维持蛋白质空间构象的作用力
作用力
破坏因子
氢键： α-螺旋，β-折叠
N
和的氢键供体（N-H基
团）通常与一个极性侧
链形成氢 键，这个氨
偶极矩
基酸残基称螺旋帽
5.4Ǻ （3.6aa）
C
特点：右手螺旋；3.6aa/圈，每个aa上升 1.5Ǻ，螺距5.4Ǻ；n氨基酸上羧基氧与n+4氨 基酸上亚胺基上的氢形成氢键。
螺旋帽
螺旋是一种普遍的蛋白质二级结构
• 1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始 过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨 基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开发 仪器的方便。1972年到德国，1977年因脑瘤过世。
• 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和相 应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是 Edman没有和他们分享Nobel化学奖.
亚硝酸盐反应 烃基化反应 酰化反应 脱氨基反应 西佛碱反应
H2N
COOH CH
成盐成酯反应 成酰氯反应 脱羧基反应 叠氮反应
R
侧链反应
（二）蛋白质的分类
分子组成：单纯蛋白质 结合蛋白质
分子形状和空间构象: 纤维状蛋白 球状蛋白
功能：酶蛋白、调节蛋白、运输蛋白等
家族分类法：螺旋-环-螺旋超家族、锌指结构蛋
为反式(trans)构型，此同一
Cα
Nφ
C
O
平面上的6个原子构成了所谓
的肽单元(peptide unit)。
•由于肽键（peptide bond） 具有双键特性，所以主链中只 有两个单键可以旋转。
两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转
多肽链的所有可能构象都 能用和两个构象角 （conformational angle) 或称二面角（dihedral angle)来描述。
原子间距离小于5Å
➢氢键（hydrogen bond)：当氢原子与一个负
极性更强的原子形成共价键时，它便具有了部分正电荷的 性质，可以被邻近的带有负电荷的原子吸引，从而形成氢 键。两个非氢极性原子之间距离小于3.5Å，而其中一个连 接了一个氢原子时，就认为它们之间存在氢键。
氢键
NH
OC
供体原子
受体原子
2.蛋白质的重要生物学功能 ➢结合
➢催化
➢开关
➢结构蛋白
二、蛋白质的组成
（一）蛋白质的元素组成
碳（C） 50％～55% 氢（H） 6％～8% 氧（O） 19%～24% 氮（N） 13%～19%，平均16%
100g样品中蛋白质含量（g%）:氮克数/克样品*6.25*100 硫（S） 0～3％ 其他（磷、铁、铜、碘、锌和钼等）
氨基端或N末端
羧基端或C末端
3.天然活性肽
通常具有重要的生物学活性： 肽类激素：催产素、抗利尿激素 神经肽：P物质、脑啡肽 抗生素肽：短杆菌素S、短杆菌素A、博来霉素
功能： （1）解毒 （2）辐射防护 （3）保护肝脏 （4）抗过敏 （5）改善某些疾病的病程和症状 （6）美容护肤 （7）增加视力 （8）抗衰老作用