菌种的衰退、复壮和保藏
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
07遗传变异-3菌种保藏
3.菌种保藏的方法
措施
低温
干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂 添加酸度中和剂
（1）斜面保藏法
方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏 措施：低温，4℃ 适用：各大类 保藏期：1~6个月，定时传代 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间
（2）石蜡油封藏法
方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液 体石蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年 优点：简便
菌种的复壮措施：
①纯种分离法
②通过宿主体复壮 ③淘汰已衰退的个体
平板表面涂布法 菌落纯 （菌种纯） 纯种分离法 细胞纯 （菌株纯） 平板划线分离法
琼脂培养基浇注法
用“分离小室”进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
C1: first set of streaks C3:
（3）砂土管保藏法
方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年
（4）冷冻真空干燥保藏
方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安瓿 管中→低温冻结（-25～-40℃）→抽真空干燥 → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCM) 中国典型培养物保藏中心（CCTCC） 美国典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 美国北部地区研究实验室（NRRL） 国家水生动植物病原库（APCCAM）
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菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。
（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。
菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。
对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。
虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。
尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。
因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。
2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。
食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。
当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。
菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。
菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。
3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。
（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。
因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。
实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。
（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。
第六章 菌种复壮衰退及保藏(与“菌种”相关文档)共44张PPT
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
第二章-菌种选育、保藏与复壮
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
菌种的衰退
每克耕作层土壤含菌量十倍递减
细菌（~108）
>放线菌（~107，孢子） >霉菌（~106，孢子） >酵母菌（~105） >藻类（~104）
>原生动物（~103）
二、水体中的微生物 1. 淡水微生物
1）数量和种类与接触的土壤有密切关系； 2）吸附于悬浮在水中的有机物上及水底； 3）多能运动，有些具有很异常的形态（例如柄细菌）； 4）靠近城市或城市下游水中的微生物多，并且有很多对健康 不利的细菌，因此不宜作为饮用水源； 5）水体自身存在自我净化作用： 水中的病原微生物会对水质产生重要影响
肠道中的正常菌群，大肠杆菌，一旦进入泌尿系统，引起尿路感染。 人体表面的正常菌群，一旦它们进入伤口也会引起感染。 条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位， 或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。
可通过口服某些活的微生物制剂 来治疗由于正常菌群失调而导致的腹泻。 •含蜡状芽孢杆菌（B.cereus）的“促菌生”， •含地衣芽孢杆菌的“整肠生”、 •枯草芽孢杆菌和肠球菌的“妈咪爱”、
上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染 并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。
“水花”或“水华”（water bloom）：
藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体(淡水水体)出现颜色， 并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。
赤潮或红潮（red tides）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。
饮用水的微生物指标： a）致病菌一般对营养要求苛刻，因此在一般的水中只能存活2~3天； 总菌数： < 100个/ml b）水表微生物会受辐射等作用而被杀灭； 大肠杆菌：< 3 个/L c）原生动物等的吞噬作用； d）由固形物吸附再沉积到水底；
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
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第五节菌种的衰退、复壮和保藏
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法
一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法
适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法
不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法
向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年
五、真空冷冻干燥保藏法
是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。
所以，都已较普遍地应用。
基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。
低温保藏。
保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。
保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。
保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。
牛奶可用离心或加热的方法脱脂。
六、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，是适用范围最广的M保藏法。
尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。
（1）原理
用液氮能长期保存菌种。
这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。
（2）操作
a 安瓿管液氮保存于超低温状态，所用安瓿管需能承受大温差而不至于破裂，一般用95料或GCl7玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。
b 菌种准备及分装因为液氮法菌种要经受超低温冷冻过程，也需要保护剂。
常用保护剂为10％甘油。
用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓿管中，安瓿管装量为0.2～1mL。
c 冻结液氮法的关键是先把M从常温过渡到低温。
这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。
美国ATCC 采用先将菌液降温到0℃，再以1℃/min的速度降低到-35℃，再把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。
因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致菌种死亡。
所以要常常注意液氮残存量，定期补加。
d 重新培养使用或检查所保存的菌种时，将安瓿管从冰箱中取出，室温或35～40℃水浴中迅速解冻，升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。
七、国内外主要菌种保藏机构
（一）国际机构：
（1）、ATCC American Type Culture Collection. Rockvill Maryland, U. S.
A. 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市。
（2）、CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U. S. A. 冷泉港研究室，美国。
（3）、IAM Institute of Applied Micribiology. University of Tokyo, Japan. 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4）、IFO Instltute for Fermentation. Osaka, Japan. 发酵研究所，日本大阪。
（5）、KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo, Japan. 科研化学有限公司，日本东京。
（6）、NCTC National Collection of Type Culture. London, United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。
（7）、NIH National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, U. S. A. 国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。
（8）、NRRL Northern Uti1ization Research and Development Division, U. S. Department of Argculture, Peoria, U. S. A. 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。
（二）国内机构：
中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of Microorganisms．CCCMS) 下设六个菌种保藏管理中心。
1、普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-Ⅳ)：病毒。
2、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。
3、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。
4、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。
卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。
中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
5、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。
四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。
华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗生素菌种
6、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。