2011分子生物学实验讲义8

生物工程教学实习-分子基础实验

实验一(1) 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化

一、实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

二、实验原理

转化( Transformation )是将异源DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM 符号表示。转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法。感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源DNA 分子的受体细胞( Transformant )。

本实验以 E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源DNA 的污染。

三、实验仪器、试剂

超净工作台；台式高速冷冻离心机；恒温空气摇床；恒温培养箱；培养皿

大肠杆菌DH5α

LB培养基，（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,溶解到1升蒸馏水中，调PH7.0,灭菌）

0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

氨苄青霉素

pUC18质粒

四、实验步骤

菌株活化

1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时

3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养12小时，到OD600＝0.3－0.8

感受态细胞制备

4．将培养液8mL在冰上放置15－30min，4000rpm离心5min,弃上清（4度）

5．加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，转入1.5ml离心管中

6．冰上预冷30min，4000rpm离心5 min,弃上清

7．加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。

转化

8．吸取200ul感受态细胞转移到无菌的离心管中，每管中加入质粒DNA1ul(不超过2ul),于冰上放置30min，设置对照不加质粒只有感受态细胞。

9．于42℃水浴90S（增加DNA吸收）

10．冰上放置2min

11．加入800μlLB液体培养基于37培养1小时

12．将200ul培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上（可以设置涂布20uL对照）

13．将平板放置于37℃恒温培养箱中培养14-16个小时，然后观察结果

对照组吸取200ul感受态细胞转移到无菌离心管中，加入2 ul无菌水，于冰上放置30min，接着9步做下去

转化率

氨苄储备液;100mg/mL,卡那储备液50 mg/mL,培养基中总浓度为:氨苄50ug/ml,卡那，25 ug/ml。固体培养基在60℃以下添加。

五、实验报告

画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率（质粒0.05ug/uL*10uL）。

实验一(2) 转化子DNA的快速鉴定

一、实验目的

1、选择性培养基上的转化子为材料检测重组质粒DNA分子的大小，选出合理的重组的转化体菌株。

2、掌握快速细胞破碎法，测定大小不等的质粒DNA。

二、实验原理

利用Cracking gel缓冲液，采用快速细胞破碎法直接从菌体中提取DNA

三、实验操作

转化子鉴定步骤：

（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的50ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。

（2）取1.2ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min 以上。

（4）15000rpm离心15min。

（5）（实验三）吸取上清点样电泳，观察。

思考题

1、Cracking gel中各成分的作用分别是什么？

2、培养基中添加抗生素的作用是什么？

实验二质粒DNA的提取、酶切与鉴定

一、目的

掌握质粒的小量快速提取法；了解质粒酶切鉴定原理。

二、原理

所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。主要原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的，细菌在氢氧化钠和SDS 溶液中裂解，蛋白质和DNA变性但是染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒DNA也会发生这种变化，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，用PH4.8乙酸钾将其PH调制中性，变性质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。

质粒DNA分子量一般在106~107道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT

G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．主要仪器

（1）塑料离心管1.5mL×30

（2）塑料离心管架×1

（3）微量加样器10μL、100μL、1 000μL各一支

（4）常用玻璃仪器及滴管等

（5）台式高速离心机（20 000r/min）

（6）电泳仪

（7）电泳槽

（8）样品槽模板

2．材料

大肠杆菌DH5α

3．试剂

（1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。

（2）pH 4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰乙酸，28.5mL H2O）

（3）酚/氯仿（1∶1，V/V）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。

（4）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/mL。

（5）TBE缓冲液：称取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，