乳酸菌细菌素的分子生物学研究进展
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董慧
什么是乳酸菌？细菌素？
• 乳酸菌是一类能够发酵糖类产生大量乳酸 的革兰氏阳性菌耐氧或碱性厌氧菌。包括 主要包括乳杆菌(Lactobacillus )、乳 球 菌 ( Lactococcus )、明 串 珠 菌 ( Leuconostoc )、 片 球 菌 ( Pediococcus )、 链 球 菌(Streptococcus )、肠 球 菌 ( E nterococcus )、双 歧 杆 菌 (Bifidobacterium )等至少23个属。
环形分子lactocin S
• 分子中有 2 个羊毛硫氨酸, 3 个Dha 和 1个 DHb
• lactocin S 的结构及免疫基因定位在粟酒乳 杆菌L 45 的一个50kb 质粒上, 负责 lactocin S 前体肽翻译后修饰及跨膜转运的基因也都 位于同一质粒上
• 许多乳酸菌能够产生具有杀菌或抑菌作用 的细菌素。
• 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核 糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的 多肽或前体多肽, 抑菌范围不仅仅局限于同 源的细菌, 产生菌对其细菌素有自身免疫性。
1、乳酸菌细菌素的分类
基于分子量、 热敏感性和是否含修饰性氨 基酸, 可将乳酸菌细菌素大致分为四类: • 小分子热稳定肽( small heat- stable peptide, SHSP) • 大分子热不稳定蛋白( largeheat - labile p ro tein, LHL P ) • 羊 毛 硫 抗 生 素( lantibiotics) • 赖于两个或两个以上小肽分子协同作用的 细菌素
• helveticin J 是由 lactobacillus helveticus (瑞士乳杆菌)481 产生的一个染色体编码的 37kDa 的细菌素, 抑菌谱较窄, 仅对一些同 源乳杆菌有效
1
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3
4
5
6
1-启动子
2-反向重复序列，可能与调控有关
3-核糖体结合区域
4-开放读码框ORF2，315bp , 编码一个 1118kDa 的未知功能蛋白
2.3转运机制
• 分析SHSP 的N - 端先导序列发现并没有典 型的信号肽结构, 除 lactacin F 外, 其它 SHSP 的N - 端先导序列中缺乏分泌蛋白信 号肽所共有的中央疏水区, 其前导序列较短, 且含有数个酸性氨基酸残基。由此提示 SHSP 中可能存在一种新型的转运机制
• 由前面讨论可知,WM 4 的 lactococcin A 结 构基因上游的 lcn C、 lcn D 基因可能参与 细菌素表达及分泌
• 根据 lantibiotics 的分子结构可将其细分为 两类: 一类是线型的, 另一类是环型的。
线性分子nisin
• nisin 前体肽由57个氨基酸组成, 其中N - 端 23 个残基构成信号肽区; 信号肽在 细胞表面被信号肽酶水解去除后, 释放 出成熟的、 有生物活性的nisin。
• nisin 是一种含 34 个氨基酸的小肽, 分 子量约为3500Da, 分子内不含芳香氨 基酸, 但含有DHa、 DHb、 羊毛硫氨 酸和 B - 甲基羊毛硫氨酸。
nisin的作用机制
• nisin 是一个疏水的带正电荷的小肽, 其作用 机制与其它 lantibiotics 相似, 作用靶位点是 细菌细胞膜。在一定膜电位存在的条件下, nisin 与细菌细胞膜结合形成通透性孔道结 构, 使A TP、 K+等小分子和离子通过孔道 流失, 造成细胞膜渗漏和去极化, 膜内外能 差消失, 因其作用需膜电位的存在, 故又称 为能量依赖性细菌素。
二级结构预测显示 lactacin F 分子N - 端有 一段 A - 螺旋, 信号肽酶切位点处则有一个 B - 转角
值得一提的是, lactococcin A、 B 和M 的前 体肽- 3 位置上均为Asn 残基, 这在其它分 泌蛋白前体的信号肽中极为罕见。Holo等 人认为 lactococcin A 的成熟过程是两步行 为: 信号肽酶首先水解 Gly- Gly 之间的肽键, 移去前体细菌素N - 端 20 个氨基酸大小的 信号肽, 然后再水解去除剩余肽段的N - 端 Gly 残基, 最后形成一个 54 氨基酸大小的 成熟细菌素
明串珠菌的细菌素基因
• leucocin A - UAL 187
leuA 58-61
ORF2 113
• pediocin PA - 1
ORF2可能负责 免疫性
pedA 62
pedB 112
pedC 174
pedD 724
将此操纵子在重组质粒中克隆并导入E.co li表达, 则产 生并分泌出了有生物活性的pediocin ped编码的724个氨基酸的蛋白，参与运输与传递。
对乳酸乳球菌双乙酰亚种WM 4 的 lactococcin A 操纵子的研究结果证实该细 菌素的结构与免疫基因位于一个 136kb 的 质粒(pN P2)上, 序列分析表明这两个基因 与 9B4 的 lactococcin A 的结构与免疫基因 相同。值得一提的是,WM 4 的 lactococcin A 操纵子结构中除 lcn A 和 lciA 基因外, 其 上游还含有 lcn C 和lcn D 基因,在 lactococcin A 的表达及分泌中起重要作用
2.2结构上的共性
• N - 末端信号肽长度均为 18～ 21 氨基酸 • 前体肽的起始氨基酸为Met, 紧随其后的氨
基酸残基通常为Lys残基 • N - 末端信号肽的- 1 和- 2 位置上为两个
Gly 残基 • 成熟的细菌素其N - 末端+ 1 位置上通常是
Lys 或Arg 残基
L actococcin A、 B、 M 的N - 末端信号肽 呈现高度同源, 提示其操纵子结构可能受同 一类启动子调控,而信号肽酶切位点 G—G 后的氨基酸序列则无明显类似性, 基于启动 子和N - 末端信号肽的高度同源性, 可以确
质粒编码细菌素的遗传图谱
• lactococcin A
lcnA
lciA
75
98
• lactococcin B
lcnB
lciB
68
91
• lactococcin M
lcnM
lcnM/b
lciM
69
77
154
乳脂乳球菌 9B4 产生的 lactococcin A、 B 和 M , 其结构( lcn)与免疫( lci)基因均定位于一个 60kb 大小的接合质粒(P9B4- 6)上。
嗜酸乳杆菌11088的细菌素基因
• lactacin F
laf
ORFX ORFY ORFZ
75
32 62 124
后三个读码框可能与细菌素的表达分泌 有关，有待研究。 利用穿梭载体将该接合质粒上一段包含 lactacin F 结构和免疫基因在内的 212kb 的DNA 片段克隆、 导入不产 lactacin 的同源乳杆菌中, 表达成功
2、小分子热稳定肽(SHSP)
• 2.1遗传学分析 • 2.2结构上的共性 • 2.3转运机制 • 2.4作用机制
2.1、遗传学分析
对乳酸菌细菌素的分子遗传学研究表明许 多细菌素的产生与质粒相关。下面分析六 种质粒编码细菌素的遗传图谱,对于每一种 细菌素, 其结构基因总是与两个或多个相关 基因紧密排列构成一个类操纵子结构模块。
定此三种细菌素生物学功能上的变异并非 源于转录水平的
研究表明, 大量分泌蛋白前体的信号肽序列 都有一个保守的三联结构: 一个带正电荷的 N - 端区域, 一个中央疏水区域和一个极性 的C- 端区域, 三个区的长度分别为 1～5、 7～ 15 和3～ 6 个残基, 其中C- 末端为信号 肽酶的识别位点, 其模式为XXA (G)↓(X 为任 意一种氨基酸, ↓为酶切位点）
2.4作用机制
• 发现纯品 lactococcin A 能够增加敏感株的 膜通透性, 导致膜电势崩溃, 使胞内和膜质 体内的氨基酸、 ATP 等营养物质外流, 但对 脂质体无效
lactococcin 在细胞膜上形成亲水性通透孔 道是经膜上特定受体蛋白介导, 与膜电位无 关, 因此又称这类细菌素为非能量依赖型细 菌素, 其作用主要是破坏膜功能的稳定性(如 能量转导)。
3、大分子热不稳定蛋白细菌素
(LHL P)
这类细菌素都是产生于乳杆菌属, 包括 helveticin J、lacticin A、 lacticin B、 acidophilucin A、和caseicin 80 等, 其 分子量较大(> 30kDa) , 对热敏感(90℃ 处理 30m in, 失活)。目前, 对这类细菌 素的研究不多, 仅 helveticin J 的研究 较为深入。
5-开放读码框ORF3，999bp，结构基因
6-ρ- 终止子
4、羊毛硫抗生素( lantibiotics)
• lantibiotics 的显著特点是分子内含有非编码 氨基酸, 包括羊毛硫氨酸、 B - 甲基羊毛硫 氨酸、 脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸 (DHb )。非编码氨基酸的存在侧面提示了 lantibiotics 在形成过程中必定经过了翻译后 的酶修饰与加工。
• nisin 的结构基因(nis A )位于染色体的可接 合转座子上, 转座子大小为70kb, 其中在 10kb的片段上分布着 nis A、 B、 T、 C、 Z、 P 和K 基因, 构成一个长度约为815kb 的多顺反操纵子, 其中5′ - 端有一个核糖体 结合位点, 3′ - 端有一个终止密码子和不依 赖于ρ因子的转录终止子; 多顺反子mRNA 含有RNA 修饰、 加工信息, 加工后产生一 个267kb 的mRNA 转录产物。
两种细菌素对脂质体无效进一步证实其抑菌 作用依赖于膜上特定受体蛋白。携有 lactococcin A 和lactococcin B 免疫基因的细 胞能对这两种细菌素产生抗性,推测免疫蛋白 可能就定位于细胞膜上。 免疫蛋白与细胞膜 表面特定受体蛋白的靶位点结合后, 使该受 体蛋白不能再介导细菌素在细菌细胞膜上形 成亲水孔道, 致使细菌对细菌素产 生抗性。 简言之, 细菌素免疫蛋白的存在抑制了膜上 亲水孔道的形成。
• lcn C 和 lcn D 基因与G-菌中负责蛋白分泌 的基因高度同源
研究发现 I L 1403 染色体上部分序列与WM 4 的 lactococcin A 基因簇序列高度同源, 提 示I L 1403 染色体上可能含有类似于 lcn C、 lcn D 的基因。 由此,将携有 lactococcin A 结构和免疫基因的穿梭质粒导入I L 1403, 借助 I L 1403 染色体上相应 lcn C 和 lcn D 基因的互补作用, 就可以合成有生物活性的 lactococcin A。
什么是乳酸菌？细菌素？
• 乳酸菌是一类能够发酵糖类产生大量乳酸 的革兰氏阳性菌耐氧或碱性厌氧菌。包括 主要包括乳杆菌(Lactobacillus )、乳 球 菌 ( Lactococcus )、明 串 珠 菌 ( Leuconostoc )、 片 球 菌 ( Pediococcus )、 链 球 菌(Streptococcus )、肠 球 菌 ( E nterococcus )、双 歧 杆 菌 (Bifidobacterium )等至少23个属。
环形分子lactocin S
• 分子中有 2 个羊毛硫氨酸, 3 个Dha 和 1个 DHb
• lactocin S 的结构及免疫基因定位在粟酒乳 杆菌L 45 的一个50kb 质粒上, 负责 lactocin S 前体肽翻译后修饰及跨膜转运的基因也都 位于同一质粒上
• 许多乳酸菌能够产生具有杀菌或抑菌作用 的细菌素。
• 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核 糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的 多肽或前体多肽, 抑菌范围不仅仅局限于同 源的细菌, 产生菌对其细菌素有自身免疫性。
1、乳酸菌细菌素的分类
基于分子量、 热敏感性和是否含修饰性氨 基酸, 可将乳酸菌细菌素大致分为四类: • 小分子热稳定肽( small heat- stable peptide, SHSP) • 大分子热不稳定蛋白( largeheat - labile p ro tein, LHL P ) • 羊 毛 硫 抗 生 素( lantibiotics) • 赖于两个或两个以上小肽分子协同作用的 细菌素
• helveticin J 是由 lactobacillus helveticus (瑞士乳杆菌)481 产生的一个染色体编码的 37kDa 的细菌素, 抑菌谱较窄, 仅对一些同 源乳杆菌有效
1
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3
4
5
6
1-启动子
2-反向重复序列，可能与调控有关
3-核糖体结合区域
4-开放读码框ORF2，315bp , 编码一个 1118kDa 的未知功能蛋白
2.3转运机制
• 分析SHSP 的N - 端先导序列发现并没有典 型的信号肽结构, 除 lactacin F 外, 其它 SHSP 的N - 端先导序列中缺乏分泌蛋白信 号肽所共有的中央疏水区, 其前导序列较短, 且含有数个酸性氨基酸残基。由此提示 SHSP 中可能存在一种新型的转运机制
• 由前面讨论可知,WM 4 的 lactococcin A 结 构基因上游的 lcn C、 lcn D 基因可能参与 细菌素表达及分泌
• 根据 lantibiotics 的分子结构可将其细分为 两类: 一类是线型的, 另一类是环型的。
线性分子nisin
• nisin 前体肽由57个氨基酸组成, 其中N - 端 23 个残基构成信号肽区; 信号肽在 细胞表面被信号肽酶水解去除后, 释放 出成熟的、 有生物活性的nisin。
• nisin 是一种含 34 个氨基酸的小肽, 分 子量约为3500Da, 分子内不含芳香氨 基酸, 但含有DHa、 DHb、 羊毛硫氨 酸和 B - 甲基羊毛硫氨酸。
nisin的作用机制
• nisin 是一个疏水的带正电荷的小肽, 其作用 机制与其它 lantibiotics 相似, 作用靶位点是 细菌细胞膜。在一定膜电位存在的条件下, nisin 与细菌细胞膜结合形成通透性孔道结 构, 使A TP、 K+等小分子和离子通过孔道 流失, 造成细胞膜渗漏和去极化, 膜内外能 差消失, 因其作用需膜电位的存在, 故又称 为能量依赖性细菌素。
二级结构预测显示 lactacin F 分子N - 端有 一段 A - 螺旋, 信号肽酶切位点处则有一个 B - 转角
值得一提的是, lactococcin A、 B 和M 的前 体肽- 3 位置上均为Asn 残基, 这在其它分 泌蛋白前体的信号肽中极为罕见。Holo等 人认为 lactococcin A 的成熟过程是两步行 为: 信号肽酶首先水解 Gly- Gly 之间的肽键, 移去前体细菌素N - 端 20 个氨基酸大小的 信号肽, 然后再水解去除剩余肽段的N - 端 Gly 残基, 最后形成一个 54 氨基酸大小的 成熟细菌素
明串珠菌的细菌素基因
• leucocin A - UAL 187
leuA 58-61
ORF2 113
• pediocin PA - 1
ORF2可能负责 免疫性
pedA 62
pedB 112
pedC 174
pedD 724
将此操纵子在重组质粒中克隆并导入E.co li表达, 则产 生并分泌出了有生物活性的pediocin ped编码的724个氨基酸的蛋白，参与运输与传递。
对乳酸乳球菌双乙酰亚种WM 4 的 lactococcin A 操纵子的研究结果证实该细 菌素的结构与免疫基因位于一个 136kb 的 质粒(pN P2)上, 序列分析表明这两个基因 与 9B4 的 lactococcin A 的结构与免疫基因 相同。值得一提的是,WM 4 的 lactococcin A 操纵子结构中除 lcn A 和 lciA 基因外, 其 上游还含有 lcn C 和lcn D 基因,在 lactococcin A 的表达及分泌中起重要作用
2.2结构上的共性
• N - 末端信号肽长度均为 18～ 21 氨基酸 • 前体肽的起始氨基酸为Met, 紧随其后的氨
基酸残基通常为Lys残基 • N - 末端信号肽的- 1 和- 2 位置上为两个
Gly 残基 • 成熟的细菌素其N - 末端+ 1 位置上通常是
Lys 或Arg 残基
L actococcin A、 B、 M 的N - 末端信号肽 呈现高度同源, 提示其操纵子结构可能受同 一类启动子调控,而信号肽酶切位点 G—G 后的氨基酸序列则无明显类似性, 基于启动 子和N - 末端信号肽的高度同源性, 可以确
质粒编码细菌素的遗传图谱
• lactococcin A
lcnA
lciA
75
98
• lactococcin B
lcnB
lciB
68
91
• lactococcin M
lcnM
lcnM/b
lciM
69
77
154
乳脂乳球菌 9B4 产生的 lactococcin A、 B 和 M , 其结构( lcn)与免疫( lci)基因均定位于一个 60kb 大小的接合质粒(P9B4- 6)上。
嗜酸乳杆菌11088的细菌素基因
• lactacin F
laf
ORFX ORFY ORFZ
75
32 62 124
后三个读码框可能与细菌素的表达分泌 有关，有待研究。 利用穿梭载体将该接合质粒上一段包含 lactacin F 结构和免疫基因在内的 212kb 的DNA 片段克隆、 导入不产 lactacin 的同源乳杆菌中, 表达成功
2、小分子热稳定肽(SHSP)
• 2.1遗传学分析 • 2.2结构上的共性 • 2.3转运机制 • 2.4作用机制
2.1、遗传学分析
对乳酸菌细菌素的分子遗传学研究表明许 多细菌素的产生与质粒相关。下面分析六 种质粒编码细菌素的遗传图谱,对于每一种 细菌素, 其结构基因总是与两个或多个相关 基因紧密排列构成一个类操纵子结构模块。
定此三种细菌素生物学功能上的变异并非 源于转录水平的
研究表明, 大量分泌蛋白前体的信号肽序列 都有一个保守的三联结构: 一个带正电荷的 N - 端区域, 一个中央疏水区域和一个极性 的C- 端区域, 三个区的长度分别为 1～5、 7～ 15 和3～ 6 个残基, 其中C- 末端为信号 肽酶的识别位点, 其模式为XXA (G)↓(X 为任 意一种氨基酸, ↓为酶切位点）
2.4作用机制
• 发现纯品 lactococcin A 能够增加敏感株的 膜通透性, 导致膜电势崩溃, 使胞内和膜质 体内的氨基酸、 ATP 等营养物质外流, 但对 脂质体无效
lactococcin 在细胞膜上形成亲水性通透孔 道是经膜上特定受体蛋白介导, 与膜电位无 关, 因此又称这类细菌素为非能量依赖型细 菌素, 其作用主要是破坏膜功能的稳定性(如 能量转导)。
3、大分子热不稳定蛋白细菌素
(LHL P)
这类细菌素都是产生于乳杆菌属, 包括 helveticin J、lacticin A、 lacticin B、 acidophilucin A、和caseicin 80 等, 其 分子量较大(> 30kDa) , 对热敏感(90℃ 处理 30m in, 失活)。目前, 对这类细菌 素的研究不多, 仅 helveticin J 的研究 较为深入。
5-开放读码框ORF3，999bp，结构基因
6-ρ- 终止子
4、羊毛硫抗生素( lantibiotics)
• lantibiotics 的显著特点是分子内含有非编码 氨基酸, 包括羊毛硫氨酸、 B - 甲基羊毛硫 氨酸、 脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸 (DHb )。非编码氨基酸的存在侧面提示了 lantibiotics 在形成过程中必定经过了翻译后 的酶修饰与加工。
• nisin 的结构基因(nis A )位于染色体的可接 合转座子上, 转座子大小为70kb, 其中在 10kb的片段上分布着 nis A、 B、 T、 C、 Z、 P 和K 基因, 构成一个长度约为815kb 的多顺反操纵子, 其中5′ - 端有一个核糖体 结合位点, 3′ - 端有一个终止密码子和不依 赖于ρ因子的转录终止子; 多顺反子mRNA 含有RNA 修饰、 加工信息, 加工后产生一 个267kb 的mRNA 转录产物。
两种细菌素对脂质体无效进一步证实其抑菌 作用依赖于膜上特定受体蛋白。携有 lactococcin A 和lactococcin B 免疫基因的细 胞能对这两种细菌素产生抗性,推测免疫蛋白 可能就定位于细胞膜上。 免疫蛋白与细胞膜 表面特定受体蛋白的靶位点结合后, 使该受 体蛋白不能再介导细菌素在细菌细胞膜上形 成亲水孔道, 致使细菌对细菌素产 生抗性。 简言之, 细菌素免疫蛋白的存在抑制了膜上 亲水孔道的形成。
• lcn C 和 lcn D 基因与G-菌中负责蛋白分泌 的基因高度同源
研究发现 I L 1403 染色体上部分序列与WM 4 的 lactococcin A 基因簇序列高度同源, 提 示I L 1403 染色体上可能含有类似于 lcn C、 lcn D 的基因。 由此,将携有 lactococcin A 结构和免疫基因的穿梭质粒导入I L 1403, 借助 I L 1403 染色体上相应 lcn C 和 lcn D 基因的互补作用, 就可以合成有生物活性的 lactococcin A。