均相时间分辨荧光技术
时间分辨荧光免疫技术
利用不同的荧光标记物，可以特异地标记不同的抗原或抗体，从而实现多种蛋白质的同时 检测，提高检测的特异性。
检测范围广
时间分辨荧光免疫技术可以检测多种类型的生物分子，包括蛋白质、细胞因子、酶、激素 等，有助于全面了解生物系统的功能和调控机制。
时间分辨荧光免疫技术的局限性
01
成本较高
时间分辨荧光免疫技术需要使用特殊的仪器设备，如时间分辨荧光免
疫分析仪，同时需要使用特定的荧光标记物，因此成本较高，限制了
其在临床上的广泛应用。
02
操作繁琐
时间分辨荧光免疫技术的操作较为繁琐，需要经过多个步骤，包括抗
原-抗体反应、洗涤、加激发剂等，需要专业技术人员进行操作，不适
合在基层医疗单位推广应用。
03
有放射性污染
时间分辨荧光免疫技术需要使用放射性元素作为荧光标记物，存在一
定的放射性污染，对环境和操作人员有一定的危害。
未来研究和发展方向
简化操作流程
通过研究新的标记物和检测方法，简化时间分辨荧光免疫技术的操作流程，降低操作难度 ，提高其普及程度。
提高检测速度
通过改进仪器设备和检测方法，提高时间分辨荧光免疫技术的检测速度，缩短检测时间， 提高其应用价值。
发展个性化医疗
结合基因组学、代谢组学等多学科技术，发展针对不同疾病和人群的个性化诊断试剂盒和 治疗方案，提高医疗服务的效率和质量。
基因表达研究
利用时间分辨荧光免疫技术可以检测生物样本中特定基因的 表达水平，有助于研究基因与疾病之间的关系。
蛋白质分析
通过时间分辨荧光免疫技术可以对蛋白质进行定量和定性分 析，了解蛋白质的生物功能和相互作用。
医学领域
疾病诊断
时间分辨荧光免疫技术可用于疾病诊断，如检测肿瘤标志物、感染性疾病抗 体等，提高诊断准确性和灵敏度。
时间分辨荧光光谱中
时间分辨荧光光谱中
时间分辨荧光光谱是一种用于研究物质在光激发后发射出的荧光光谱的技术。
它可以提供关于分子结构、动力学和相互作用的有用信息。
时间分辨荧光光谱通常涉及到以下几个方面：
1. 时间分辨测量原理，时间分辨荧光光谱是通过对样品施加脉冲激发光源，然后测量样品在不同时间点上发射的荧光信号来实现的。
这种方法可以提供有关分子在不同时间尺度上的行为的信息，比如激发态寿命、能级交叉和分子内动力学等。
2. 应用领域，时间分辨荧光光谱在生物化学、材料科学、环境监测等领域有着广泛的应用。
例如，在生物医学领域，可以利用时间分辨荧光光谱研究荧光标记的生物分子在细胞内的动态过程；在材料科学中，可以通过时间分辨荧光光谱来研究半导体材料的光致发光和退火过程。
3. 数据分析，时间分辨荧光光谱产生的数据通常需要经过复杂的数据处理和分析。
这包括对光谱数据进行去噪、拟合和解卷积等处理，以提取出样品的动力学信息。
4. 仪器设备，进行时间分辨荧光光谱实验通常需要高性能的激发光源、光学检测系统和数据采集设备。
常见的实验装置包括飞秒激光器、光电倍增管、光栅和高速数字采集卡等。
总的来说，时间分辨荧光光谱技术在研究分子的动力学过程和相互作用方面具有重要的应用，对于揭示物质的性质和行为具有重要意义。
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法是两种常用的生物分子检测方法。
kinase-glo激酶发光法是一种非放射性检测方法，用于检测激酶活性。
该方法基于ATP的化学发光反应，通过测量发光强度来定量测定激酶活性。
该方法具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的优点，因此在生物分子检测中广泛应用。
均相时间分辨荧光法是一种基于时间分辨技术的荧光检测方法。
该方法使用具有长寿命的荧光标记物，可以在无需分离样品的情况下进行直接检测。
该方法具有高灵敏度、高选择性、低背景干扰和可同时检测多个分子的优点。
在生物分子检测中，均相时间分辨荧光法可以用于检测蛋白质、核酸和细胞等生物样本中的目标分子。
这两种方法在生物分子检测中各有优缺点，选择哪种方法取决于具体的实验需求和条件。
在实际应用中，需要根据实验目的、样本类型、检测灵敏度和特异性等方面进行综合考虑，选择最适合的方法进行检测。
均相时间分辨荧光技术
卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光分析法 - 副本
现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、 下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等各个方面。
AFB1的作用机制及对人体的危害
AFB1 干扰信息RNA 和DNA 的合成，是在翻译水平上干扰了蛋白质生物 合成，影响细胞代谢，因而它与人类及动物的许多疾病存在着联系。
AFB1引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎, 肝区疼痛，黄疸，肝硬化, 肝坏死乃至死亡，还可有心脏扩大、痉挛、昏迷、胃肠道大出血等异常表现。 长期食用被AFB1 污染的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原 因，也能诱发肾癌、乳腺癌及卵巢癌等。
发展过程中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含量,对于了解它们病理生理 作用是十分重要的。
1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临床上常检测补体C3来 评价免疫系统的功能。
2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的理论形成后,
研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法.
分析缓冲液、增强溶液。
基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、 钇(yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽 (terbium ,Tb)、钐(samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以
均相时间分辨荧光
Bagnols-sur-Cèze法国-2009年11月5日-Cisbio Bioassays ()公司是IBA旗下的子公司，也是药物研究和药物筛选领域HTRF (均相时间分辨荧光)技术的发明者。
今天Cisbio公司宣布，其在中国和韩国已建立了自己的销售团队，以便进一步开发亚洲市场。
本土销售团队将能让Cisbio为这两个迅速增长的生物制药市场的客户提供GPCR和激酶研究的HTRF平台、生物标志物检测以及其他相关的服务。
Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk 以及Tag-lite™细胞表面受体平台。
这些业务将会通过IBA集团旗下的IBA中国分公司()来操作。
为了在亚洲市场拓展应用于癌症诊断和治疗方面的放射药物产品、仪器和方法, IBA集团于2007年建立了IBA中国公司。
韩国的销售业务则由位于首尔的代理商JCBio公司(www.jcbio.co.kr)负责。
JCBio公司专注于为制药和生物技术实验室提供相关商品。
“在过去的10年里，我们一直致力于在欧洲、北美和亚洲建立本土化的团队，针对特定市场并拓展我们在当地的业务。
” Cisbio Bioassays 市场部主管François Degorce说道，“我们的目标是成为一个客户至上的服务性公司，并让业务遍及全球。
我们在中国和韩国的团队将帮助我们促进与该两个重要市场的客户的关系。
”作为2009年度 Frost & Sullivan北美技术创新奖项的获得者，Cisbio Bioassays凭借着其专利技术HTRF领先于均相荧光方法领域。
HTRF是一种很灵敏且稳定的技术，主要应用于药物研发的高通量筛选阶段。
除了基于HTRF的一些产品外，Cisbio还能提供一系列的定制服务，其包括：为客户特定的实验蛋白，抗体或化合物等进行标记，为客户设计和研发实验方法，以及为客户提供HTRF 技术培训。
时间分辨荧光分析技术
1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。
本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。
1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。
其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。
图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。
1020152530355E N E R G Y ,103c m -16H 5/2G 5/26H 15/27F 0F 2D 05D17F 6F 545D313/249/2Sm 3+Eu 3+Tb 3+Dy 3+H 9/2图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。
当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。
以铕(III)配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。
HTRF 技术
HTRF (homogeneous time resolved fluorescence)HTRF®是均相时间分辨荧光技术的简称，HTRF®技术是对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，为法国Cisbio公司的专利技术。
HTRF®技术结合了FRET 和时间分辨荧光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）两种技术。
能量供体：Eu或Tb标记的穴状化合物元素；能量受体：XL665或d2----基于穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。
在FRET中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。
因为Eu 的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体（acceptor）上，发射波长为665nm。
665nm的发射光仅仅由供体（donor）引起的FRET产生。
所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。
FRET利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。
Donor 被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor 比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor 上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。
将Donor 和Acceptor 分别与相互作用的生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor 和Acceptor 拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor 的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用
自动化程度高
该技术可以实现自动化检测， 提高检测效率，减少人为误 差。
技术挑战
标记物稳定性
荧光标记物的稳定性对检测结果 的准确性影响较大，需要保证标
记物在长时间内保持稳定。
仪器成本
时间分辨荧光免疫分析技术需要使 用特定的荧光检测仪器，仪器成本 较高，限制了该技术的普及应用。
操作复杂度
相对于其他免疫分析技术，时间分 辨荧光免疫分析技术的操作较为复 杂，需要专业人员进行操作和维护。
临床诊断
临床诊断
时间分辨荧光免疫分析技术可用于临床诊断，特别是对肿瘤、传染病、内分泌等疾病进 行检测和诊断。通过检测患者体内的特异性抗体或抗原，实现对疾病的早期发现和准确
诊断。
临床诊断的应用
时间分辨荧光免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等优点，在临床实践 中得到广泛应用。它可用于检测肿瘤标志物、病毒抗体、激素水平等，为医生提供准确
02
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理
荧光物质
荧光物质
荧光物质是时间分辨荧光免疫分析中的关键成分，通常是一些具有较长荧光寿 命的稀土金属离子或螯合物。这些荧光物质在特定波长的光激发下，能够发射 出波长较长、持续时间较长的荧光信号。
荧光物质选择
选择适当的荧光物质是时间分辨荧光免疫分析技术的关键，需要考虑到荧光的 稳定性、特异性、灵敏度以及与抗原或抗体的结合能力等因素。
可靠的诊断依据。
环境监测
环境监测
时间分辨荧光免疫分析技术也可应用于 环境监测，如水质检测、空气质量监测 等。通过标记环境中的有害物质或污染 物，利用荧光信号的发射和检测，实现 对环境质量的实时监控和评估。
VS
环境监测的应用
时间分辨荧光免疫分析技术可用于检测水 中的重金属离子、有毒有机物、细菌和病 毒等，以及空气中的有害气体和颗粒物。 这有助于及时发现环境污染问题，保障公 众健康和生态安全。
htrf法
htrf法
HTRF是均相时间分辨荧光技术的缩写，是一种免洗技术，用来检测纯液相体系中待测物。
它结合了荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特性融合在一起，提供了更高的灵敏度和稳定性。
对于夹心实验，HTRF技术使用两种识别感兴趣蛋白质的抗体，其中一种抗体与供体结合，另一种与受体结合。
如果两个抗体识别分析物，供体激发时会发出荧光，能量会转移到附近的受体，从而产生特定的受体荧光。
供体荧光也被测量，并与受体荧光的比率被应用。
HTRF技术可应用于G蛋白耦联受体研究、激酶活性检测、免疫检查点检测、细胞因子分泌检测、抗体检测等领域，目前广泛应用于新药研发候选药物的大通量筛选。
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法 -回复
kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法-回复KinaseGlo激酶发光法和均相时间分辨荧光法是生物科学领域中常用的实验方法，用于研究细胞信号传导和蛋白质激酶活性。
本文将详细介绍这两种实验方法的原理、步骤和应用。
一、KinaseGlo激酶发光法1.原理：KinaseGlo激酶发光法是一种测定激酶活性的方法，通过检测细胞中激酶活性的变化来研究细胞信号传导。
该方法利用一种特殊的底物，当底物被激酶磷酸化后，会释放出化学能量，激发一个化学反应，最终产生可检测的光信号。
2.步骤：步骤一：准备细胞样品，可以是细胞培养物或组织样品，根据实验需要选择合适的细胞类型和培养条件。
步骤二：制备样品溶液，将细胞样品裂解，并加入适量的底物和试剂，使其反应。
反应时间、试剂浓度等参数可以根据实验需要进行调整。
步骤三：检测光信号，将反应体制转移到适当的检测平台上，一般是一个带有光学检测器的微孔板读板器。
通过引入一种化学荧光基团和底物反应产物，激发光信号的产生。
步骤四：数据分析，将得到的光信号进行定量分析，通常是通过比较不同样品的光信号强度，计算出激酶活性的变化。
3.应用：KinaseGlo激酶发光法在生物医学研究中具有广泛的应用价值。
例如，在肿瘤治疗研究中，可以利用该方法研究激酶抑制剂对肿瘤细胞中激酶活性的抑制效果；在生物标志物研究中，可以利用该方法研究某些激酶活性与疾病的相关性；在药物筛选中，可以利用该方法研究激酶抑制剂的效果等。
二、均相时间分辨荧光法1.原理：均相时间分辨荧光法是一种用于研究生物分子的荧光性质和行为的方法。
该方法基于荧光分子在激发后发射光信号的特性，通过时间分辨荧光光谱的测量，可以获得样品中荧光分子的信息。
2.步骤：步骤一：制备样品溶液，根据实验需要选择适当的溶剂和浓度，将待测的荧光分子溶解其中。
步骤二：激发荧光分子，通过激光或其他合适的光源激发样品中的荧光分子。
步骤三：测量荧光信号，使用时间分辨荧光光谱仪测量样品中的荧光光谱，并记录下相应的荧光强度和发射波长。
时间分辨荧光光谱技术在材料研究中的应用研究
时间分辨荧光光谱技术在材料研究中的应用研究时间分辨荧光光谱技术（time-resolved fluorescence spectroscopy，TRFS）是一种快速、高效、精确的科学研究方法，在材料研究中有着广泛的应用。
其利用荧光现象，结合光学、化学、物理等多学科知识，能够精确测量物质发出的荧光强度、寿命等信息，为材料结构、性能的研究提供了重要的支持和帮助。
我们知道，荧光是指物质在受到外部刺激（如吸收能量、电子激发、分子振动等）后，自发地发出的能量。
荧光的强度、频谱和寿命等特性均与物质的性质相关，因此可以通过对荧光信号的测量来了解物质的结构和动力学特性。
这就是时间分辨荧光光谱技术所起的作用。
时间分辨荧光光谱技术的优势主要体现在以下几个方面：一、高精度时间分辨荧光光谱技术可以精确测量物质的荧光寿命，即发生时刻到信号消失时刻所经过的时间。
这种寿命与物质的结构和动力学特性密切相关，并在材料研究中具有十分重要的意义。
与传统的静态荧光测量方法相比，时间分辨荧光光谱技术的精度更高，且能够避免有机物质间的能量传递和猝灭等现象对测量结果的干扰。
二、快速响应TRFS技术的时间分辨度较高，能够在很短的时间内响应和测量各种化学或生物体系的动力学过程。
该技术可以用于物质结构和反应动力学研究、药物作用进程研究、受体与配体相互作用研究等领域。
三、灵敏稳定时间分辨荧光光谱技术具有很高的灵敏度和可靠性，能够通过测量荧光的强度和寿命等来分析物质的性质变化和结构变化，从而更好地理解物质的特性和行为。
四、适用性强时间分辨荧光光谱技术可以用于研究各种物质（如无机、有机化合物、分子、生物分子等）的发光现象和特性。
它还可以对多种材料（如药物、配体、蛋白质、无机材料等）在特定环境下的光生物学效应进行研究，为材料特性探究提供有效手段。
综上所述，时间分辨荧光光谱技术在材料研究中有着重要的应用价值。
其技术特点和优势，为材料科学家研究材料结构和性能变化提供了新的思路和方法。
均相时间分辨荧光技术 ppt课件
让-马里·莱恩 （Jean-Marie Lehn）
背景简介——穴状配合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼 能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于 跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合 体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子 （ Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（ EDTA）、溶剂或者温度。
从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血 清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗 干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。
专利号： US Patent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，让-马 里·莱恩在 1987 年获得了诺贝尔 奖。
时间分辨荧光（ TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特 性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐（ Sm）、铕（ Eu）、 铽（ Tb）和镝（ Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大 的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒）， 这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。
一、时间分辨荧光
镧系元素是57～71的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀 土元素的成员。
背景简介——穴状配合物
Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免 疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面 研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药 物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行 药物研发。
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卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
解决方法：
背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的 荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。 背景荧 光非常短暂（寿命为纳秒级） ，可以利用时间分辨荧光方法将其去除。
三、HTRF 技术原理
HTRF技术原理
HTRF技术结合了FRET和TRF两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和 XL665作为一个供体，是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的FRET。在FRET中， 受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体 会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过TRF就可 以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血 清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗 干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。
专利号： US Patent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，让-马 里·莱恩在 1987 年获得了诺贝尔 奖。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
PART 02
HTRF技术原理
HTRF技术原理
HTRF 技术 荧光共振能量转移 时间分辨荧光
HTRF 技术的 主要实验方法 HTRF技术特点
一、时间分辨荧光
在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光 的，利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏 度。使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧 光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干 扰降到最低。
让-马里·莱恩（Jean-Marie Lehn，1939年9月30日出生）是法 国化学家。他于1987年与Donald Cram和Charles Pedersen因为他的 穴状配合物的合成，一起获得了诺贝尔化学奖
让-马里·莱恩 （Jean-Marie Lehn）
背景简介——穴状配合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼 能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于 跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合 体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子 （ Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（ EDTA）、溶剂或者温度。
三、HTRF 技术原理
HTRF 技术的能量供体和能量受体
HTRF 的供体是铕穴状化合物（ Eu3+ cryptate）（图a） 或Lumi4™铽穴状化合物（ Tb2+ cryptate） （图b，未发表结构），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体 均可为 XL665 和 d2。 XL665 和 d2 激发波长为620nm，发射波长为 665nm，位于红外光区，进一步降 低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量转移利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor） 和能量受体（Acceptor）。能量供体被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与能量受体比较接 近，可以将能量共振转移到在能量受体上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。将能量供体和能 量受体分别与相互作用 的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将能量供体和能量受体拉到足够 近的距离，产生能量转移，由于能量受体的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结 合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。
的有机结构。作为一个小得多的实体，d2限制了在XL665基TR-FRET系统中有时怀疑的空间位阻问题。 这些近红外受体也特别适用于均相测定，因为它们的发射不太可能受到典型复合筛选过程中出现的 内在介质或化合物自发荧光的干扰。这些红色受体的特性也使它们适合与铽穴合物结合。此外，由 于其发射光谱中有额外的峰，铽隐晶质可与荧光素等绿色受体偶联，在520 nm范围内发射，例如可 允许设计具有两个读数的多重测定。
四、HTRF 技术特点
时间选择（时间延迟读取测 01
量），读数稳定24 小时以上， 甚至可达 7 天
03 低背景，化合物和培养
基的干扰小
能抵御金属离子对信号的影响，对 05
酸性溶液、 Mg2+、 Mn2+、 DMSO、 EDTA 比较耐受
02 荧光持续时间更久
04 校正干扰因素
06 均相检测，不需要洗 板），操作简单
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
镧系元素是57～71的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀 土元素的成员。
背景简介——穴状配合物
Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免 疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面 研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药 物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行 药物研发。
三、HTRF 技术原理
能量受体：XL665和 第二代受体d2
XL665是一种105 kDa的大型杂六聚体，经过分离后交联，以便在HTRF分析中获得更好的稳定性 并保持其光物理特性。与荧光素不同，它与Eu cryptates完全兼容。它是红移的，其发射更可能远离 可能的中等和复合干扰。
d2 是第二代受体，具有与XL665非常相似的一系列光物理性质，但其特征在于比XL665小100倍
当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释 放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体上，发射波长为 665nm。665nm的发射光仅仅由 供体引起的FRET产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和 665nm；当不存在相 互作用时，只有620nm一个激发光。
背景简介 原理 应用 展望
PART 01
简介
背景简介
均相时间分辨荧光（ HTRF ，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体 系中待测物的一种常用方法，主要用于高通量药物筛选，是研究药物靶标的理想平台。HTRF技术使 用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰期 ；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种 结合的穴状物与其它所有使用的螯合物的产品相比，显著增加了稳定性（可耐受低pH值、金属离子、 DMSO、EDTA 等）
通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系元素必 须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。稀 土元素螯合物和穴状配合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上， 后者则发出其特征性的长寿命的荧光。
为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高 的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受荧光 淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状配合物结合，许多限制因素都 可去除。
三、HTRF 技术原理
HTRF技术中镧元素与穴状配合物的结合
HTRF中使用四种特定的荧光团形成不同的TR-FRET系统。中心元素能量供体是铕穴合物。这些稀 土配合物基分别具有Eu3+离子或Tb2+紧密嵌入的大环。这些离子本身不发荧光;他们需要一个光收集装 置（即笼）被激发。与其他发光镧系元素技术中螯合物的功能类似，该笼子作为天线，允许能量收 集和转移到离子，最终以特定的荧光模式释放该能量。特别是，这些穴状配合物不受影响许多常规 荧光团的光漂白，并且离子几乎与它们的大环化合物不可分离。然而，由于独特的笼状结构，穴状 化合物的动力学稳定性远高于这些镧系元素螯合物。稀土螯合物在酸性介质中或存在二价离子如 Mn2+时会解离并不稳定，而稀土穴合物在宽范围的化学条件下非常稳定，如在三氟乙酸存在下的反 相色谱，并且不受影响通过介质中二价离子的存在。因此，它可以在灵敏度，测定窗口和稳定性方 面提高检测性能，同时不会影响HTRF为检测带来的特性和优势。