焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理

(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序

Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion

焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文

焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。

正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。

焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。

该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。

近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。

该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。

关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。

如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。

经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。

后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。

荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。

20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。

1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。

1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。

目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。

如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。

焦磷酸测序名词解释

焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。

焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。

焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。

相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。

但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。

尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。

未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。

1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。

焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。

具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。

焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。

自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。

2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。

焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。

焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。

2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。

3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。

焦磷酸测序技术及其应用进展

·综述·焦磷酸测序技术及其应用进展倪红兵综述　鞠少卿　王惠民审校【摘要】　焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DN A序列分析的技术。

在DN A聚合酶、A T P硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dN T P聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DN A序列的目的。

此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。

【关键词】　焦磷酸测序技术;　单核苷酸多态性;　DN A序列分析 DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,而双脱氧核苷酸链终止法(Sange r法)是目前使用得最普遍的DNA序列分析技术。

在基于San-g er法的全自动DNA测序技术中,测序反应产生的DNA片段是荧光标记的,这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离,荧光分子被激发而发光,发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列,且单向反应的读序较长,目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证,而这种分析往往测几十对碱基(beas pair,bp)就可以满足需要。

在这种情况下,Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。

新发展的焦磷酸测序技术(Py rosequencing)应该是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。

焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术,该技术对DNA的序列分析无须进行电泳,DNA片段无须荧光标记,因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置。

本文将就焦磷酸测序技术的原理和应用等方面作一综述。

焦磷酸测序技术1.焦磷酸测序技术的原理:焦磷酸测序技术是由Ronaghi等[1,2]于1987年发展起来的一种新型的DNA测序技术,其核心是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。

基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]

o
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计测序 PCR 试样预处理，获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生

焦磷酸测序原理

焦磷酸测序原理引言:随着生物学研究的深入，基因测序技术得到了广泛应用。

而焦磷酸测序作为一种常见的测序方法，具有高通量、高精度和高效率的特点，被广泛应用于基因组学、遗传学和生物医学研究领域。

本文将介绍焦磷酸测序的原理及其应用。

一、焦磷酸测序原理概述焦磷酸测序（pyrosequencing）是一种基于酶反应的测序技术，通过检测DNA链合成过程中的焦磷酸释放，实现对DNA序列的测定。

其原理可概括为以下四个步骤：DNA样本制备、PCR扩增、焦磷酸测序反应和数据分析。

二、DNA样本制备焦磷酸测序需要从样本中提取目标DNA，并进行纯化和定量。

常用的DNA提取方法有酚/氯仿提取法、离心柱法等。

提取得到的DNA需要进行纯化，去除杂质。

纯化后的DNA样本需要定量，以确保测序反应的准确性和可靠性。

三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种体外合成DNA的技术，在焦磷酸测序中起到扩增DNA片段的作用。

通过PCR反应，可以将目标DNA片段快速扩增至足够数量进行测序。

PCR扩增需要合适的引物，引物的选择要根据待测序列的特点进行设计，以确保扩增效率和特异性。

四、焦磷酸测序反应焦磷酸测序反应是焦磷酸测序的核心步骤。

在反应中，通过在DNA 合成过程中的每个碱基加入一种特殊的酶和核苷酸，使其发生焦磷酸释放的反应。

这种酶反应会引起光信号的释放，并被荧光探测器所检测。

不同的碱基在加入后会产生特定的光信号，通过检测这些光信号的顺序，可以确定DNA序列。

五、数据分析在焦磷酸测序中，荧光强度与焦磷酸释放的数量成正比，通过分析测序反应过程中的荧光信号，可以获得DNA的碱基序列。

数据分析是整个焦磷酸测序过程中非常重要的一步，需要对荧光信号进行处理和解读。

通常使用专门的测序分析软件进行数据处理，根据荧光信号的峰值和强度，确定DNA序列。

六、焦磷酸测序的应用焦磷酸测序技术具有高通量、高精度和高效率的特点，广泛应用于基因组学、遗传学和生物医学研究领域。

甲基化检测之金标准焦磷酸测序技术

甲基化检测之⾦标准焦磷酸测序技术中科普瑞作为中国⼗万⼈甲基化组计划的执⾏⽅，对甲基化检测的相关技术进⾏了优化升级，建⽴了专业的甲基化检测⼀站式服务平台。

今天⼩编为⼤家介绍甲基化检测的⾦标准—焦磷酸测序技术，后⾯陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，已成为甲基化检测的⾦标准。

焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同⼀反应体系中的酶级联化学发光反应。

具体过程如下：步骤1：扩增DNA⽚段并对焦磷酸模板链进⾏⽣物素化。

通过变性，分离⽣物素化的单链PCR 扩增⼦并使其与⼀条测序引物进⾏杂交。

步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。

步骤3：第⼀个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引⼊反应。

DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进⾏延伸。

每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。

步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。

⽣成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并⽣成与ATP的数量成⽐例的可见光。

电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所⽣成的光，并将其作为原始输出数据中的⼀个峰值（热解图Pyrogram）。

每个峰值（光信号）的⾼度与核苷酸结合的数⽬呈⽐例关系。

步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进⾏分解。

当分解完成时，便会引⼊另⼀个核苷酸。

步骤6：dNTP的添加反应在持续进⾏着。

应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利⽤，却并不会被荧光素酶所识别。

焦磷酸测序

焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。

在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。

新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。

PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。

反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。

反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

焦磷酸测序技术简介及临床意义

焦磷酸测序技术简介及临床意义
PyrosequencingTM (焦磷酸测序技术)是一种基于4种酶的级联反应来进行定量序列分析的技术。

通过对病人样本DNA序列的直接测定，从而与已知DNA序列进行对照，从而对病人的病情作出判断。

不仅可以指导临床用药，甚至可以对未来的病情发展做出预测。

目前焦磷酸测序技术越来越多的应用在病毒的分型和耐药分析、微生物快速鉴定和肿瘤的个性化治疗中。

与传统的检测方法相比，焦磷酸测序技术由于是直接得到目的核酸片段的序列，所以又被称为分子诊断中的“金标准”。

焦磷酸甲基化测序

焦磷酸甲基化测序DNA甲基化是近年来研究的热点，因为越来越多的证据表明，它参与了胚胎发育、基因印迹等过程。

同时，它在疾病发展中也起着举⾜轻重的作⽤。

甲基化状态的改变被认为是引起癌症的⼀个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化⽔平的降低和CpG 岛局部甲基化⽔平的异常升⾼，从⽽导致基因组的不稳定（如染⾊体的不稳定、原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。

DNA的甲基化分析，有很多条路可以选择，从亚硫酸氢盐转化这条主⼲道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、测序和焦磷酸测序等。

然⽽，并⾮所有⽅法都能提供单个CpG位点的定量数据。

亚硫酸氢盐处理+测序⼀度被认为是甲基化分析中的⾦标准，但如果对5-10个克隆测序，这种⽅法充其量只是半定量。

焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。

通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本⾝能检测并定量甲基化⽔平上的细微改变。

在序列延伸过程中，根据C和T的掺⼊量来定量确定单个位点的C-T ⽐例。

因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。

由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

同时，新⼀代测序（NGS）在甲基化研究中也开始崭露头⾓。

454（后被罗⽒收购）以焦磷酸技术为基础，开发出了新⼀代测序平台。

之后，Illumina的Solexa测序仪和ABI的SOLiD测序仪陆续推出。

这些⼤规模并⾏测序平台带来了不断提⾼的通量，同时使测序成本不断下降，⽬前正⼴泛应⽤于基因组测序和重测序、转录组分析和表观基因组研究。

对于甲基化研究，这些平台带来了⾮常灵敏的DNA甲基化图谱，以单分⼦分辨率覆盖整个CpG岛。

新技术不断涌现，我们在实际应⽤中应如何选择，才能发挥出它们本⾝的优势。

科学家们也在不断探索。

德国汉诺威医学院Anna Potapova领导的研究⼩组对454测序和QIAGEN的焦磷酸测序进⾏了系统的交叉验证。

焦磷酸测序

罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。

在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。

通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。

此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。

测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。

2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。

短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。

3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。

接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。

图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。

4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。

5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。

经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。

6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。

pyrosequencing焦磷酸测序

Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
1. Assay Design
Example of a general target: 16S gene
Relative
1,000 0,900
Relative peak height =
75 %
peak1 height peak1 height + peak2 height
peak height
0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1分子的分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1 dNTP掺入 PPi ATP， ATP，产生单位强度的光信号
Pyrosequencing： Pyrosequencing： Quantitative Accuracy Test
C/C C/G G/G
PCR产物中加入 streptavidine包被的 sepharose beads
EtOH NaOH
振荡温育 5-10 min 变性，生物素标记的单链结合于beads并被真空吸附于Vacuum Prep Tool上
Water Washing buffer
PCR product immobilize d on Sepharose beads

焦磷酸测序

焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。

在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。

新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。

PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。

反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。

反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理

焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。

焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otide potymorphisms，SNP s)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。

1.焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。

反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。

2.焦磷酸测序技术的反应过程在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。

如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。

焦磷酸测序

Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。

第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。

第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。

注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。

每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

第五步——然后加入下一种dNTP。

在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。

利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

e7-3焦磷酸测序与深度测序

e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。

PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。

每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。

第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。

整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。

反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。

（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。

dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。

（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。

通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。

（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。

（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

焦磷酸测序技术的原理

3.2焦磷酸测序的定量特性
在同一焦磷酸测序反应体系中，产生的荧光信号强度与ATP的量成正比，而ATP的量与聚合的dNTP个数成正比，所以可以根据图谱中测得的信号强度推测出模板DNA相对含量。为了验证焦磷酸测序的定量特性，人为设计了一条测序单链(5′ GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC 3′ )和一条测序引物(5′ GCGGGCGGGG 3′)，使测序单链的3′端与测序引物单链的5′端完全互补。两条单链退火后按dTTP→dGTP→dATPαS→dCTP的顺序循环递加dNTP进行测序反应。结果显示，待测模板上测序引物的延伸序列为“T G A C TT GG AA CC”12个碱基，其信号强度跟同质区的相同碱基个数成正比。这一结果表明，峰强度与被引物延伸模板的量成正比，可通过测定各峰的峰高之比确定对应的模板的相对含量。本研究利用焦磷酸测序技术的定量特性，通过测序图谱中的峰高比值分析不同来源的基因相对表达量。
3结果与讨论
3.1方法原理
焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。其原理是：引物与模板DNA退火后,在DNA聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。产生的荧光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。反应方程式如下：