电化学发光免疫分析方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但
化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。
化学发光免疫分析
（CLIA）
• CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一
种新的免疫分析技术。
• 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的
高度特异性。
化学发光免疫分析（ CLIA）分 类
• 按标志物的不同及反应原理的不同分为
• 直接化学发光免疫分析 • 化学发光酶免疫分析 • 电化学发光免疫分析
电化学发光
• 电化学发光（ECL）是通过在电极上施加一定
的波形电压或电流信号进行点解反应的产物之 间或与体系中共存组反应产生化学发光的现象
电化学发光剂
• 定义:指通过在电极表面进行电化学反应而发出
光的物质
• 特点： • 反应在电极进行 • 化学发光剂：三联吡啶钌 • 电子供体为：三丙胺
电化学发光免疫分析法
11月 刘博
• 免疫分析法 • 发光和化学发光 • 化学发光免疫分析法 • 电化学发光 • 电化学发光免疫分析法 • 甲状腺功能介绍
免疫分析
• 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种
手段；
• 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏
感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上， 通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系 统中抗原或抗体的性质与含量。
• 感染性疾病:衣原体抗体、弓形虫抗体、
风疹病毒抗体等
• 其它
• 如一些心脏标志物、病毒标志物、治疗药物
的监测等
甲状腺功能项目： 促甲状腺素（TSH）、 游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、 游离甲状腺素(FT4)、 三碘甲状腺原氨酸（T3）、 甲状腺素（T4）、 抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-TG)、 抗甲状腺过氧化物酶抗体（Anti-TPO) 。
血液后可刺激机体产生Anti-TG抗体。 Anti-TG，测定 有助于诊断自身免疫疾病。
• 临床意义：在自身免疫性甲状腺炎患者中可发现AntiTG抗体浓度升高出现频率大约是70%-80%。Graves 病Anti-TG抗体的阳性率约60%，经治疗后滴度下降提 示治疗有效。甲亢病人测Anti-TG阳性且滴度较高，提 示抗甲状腺药物疗效果不佳，且停药后易复发。
总三碘甲状腺原氨酸(TT3)：
• 介绍：10%～20%T3由甲状腺合成与释放，80%～90%来自于周围组
织T4的脱碘转化成T3。T3为主要发挥生物活性的甲状腺激素。血清 中T3的绝大多数(99.5%)与血浆中特异蛋白结合，仅极少数处于游离 状态(0.5%)。血清中TT3浓度的改变，表示甲状腺功能的异常，TT3 浓度的改变常和TT4平行，但有时存在差异，如T4型甲亢，TT3则正 常。因此，临床上常同时测定TT3和TT4值。
• 正常参考值：5.10-18.00ug/dl
抗甲状腺过氧化物酶自身抗体 （TPOAb） ：
介绍：甲状腺过氧化物酶是甲状腺微粒体的主要抗原成分，其功能与甲状 腺素的合成有关。抗甲状腺过氧化物酶抗体或抗甲状腺微粒体抗体可能使 甲状腺细胞损伤。检测抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法与抗甲状腺球蛋白 抗体类似。测定抗甲状腺过氧化物酶抗体的临床意义与抗甲状腺球蛋白抗 体也大致相同，主要对于慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进症、 原发性甲状腺功能减退症，有辅助诊断、疗效考核价值。 临床意义：
• 临床意义： • 增高：TT3是诊断甲状腺功能亢进(甲亢)最灵敏的指标，甲亢时TT3
可高出正常值4倍；同时TT3是诊断T3型甲亢的特异性指标。
• 降低：常见于甲状腺功能减低(甲减)。 • 正常参考值：血清TT3值与年龄有关，出生后TT3水平高于正常成人，
5岁后随年龄增长逐渐下降，老年人TT3常低于正常人。成人： 0.73～2.88ng/ml。
降低：甲状腺功能减退(原发性)、垂体性或者无痛性亚急 性甲状腺炎的一过性功能减退期、低白蛋白血症。
• 正常参考值：0.93～1.70ng／dL
促甲状腺激素（TSH）：
• 介绍：促甲状腺激素是腺垂体分泌的促进甲状腺的生长和
机能的激素，具有促进甲状腺滤泡上皮细胞增生、甲状腺 激素合成和释放的作用。
• 临床意义：
桥本(Hashimoto)甲状腺炎患者血清中ATG检出率可达90%～95%;甲状 腺功能亢进患者检出率40%～90%不等，检出率高的可能与部分病例属 于桥本甲亢有关;原发性甲状腺功能低下症患者检出率65%左右。
参考值：0.00-34.00IU/mL
抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-TG)
• 介绍：甲状腺球蛋白是一种潜在的自身抗原，当进入
ECLIA特点
• 三联吡啶钌在电场中不断得到电子，可持续发
光，信号强度高，容易测定容易控制 不影响标志物的理化特性
• 三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，
• 试剂灵敏度高，稳定性好
ECLIA优越性
• • • •
高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂灵敏度高，稳定性好，无毒害，无污染，有效期 长，达数月甚至数年。
电化学发光免疫分析 （ECLI)
• ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧
光免疫技术之后的新一代标记免疫测定技术；
• ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物； • ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。
ECLI原理
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，
用电化学发光剂三联吡啶钌标记Ab(Ag),通过AgAb反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量或定性 分析。
• 操作简单，耗时短，易于自动化。
临床应用
• 由于该技术无放射性污染，同时有放射免疫测 • • • •
定的灵敏度，且具有快速、准确、特异、可自 动化等特点，广泛应用于以下几个方面: 激素:甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质 激素 肿瘤标记物:AFP、CEA、PSA、CA199、CA125、 CA153等 贫血因子:VB12、叶酸、铁蛋白、转铁蛋白等 糖尿病:胰岛素、血清C-肽、血浆胰高血糖素等
增高：原发性甲状腺功能减退、伴有甲状腺功能低下的桥 本病、亚急性甲状腺炎恢复期。摄人金属锂、碘化钾、促 甲状腺激素释放激素可使促甲状腺激素增高。 降低：垂体性甲状腺功能低下、非促甲状腺激素瘤所致的 甲状腺功能亢进，以及摄入阿司匹林、皮质激素及静脉使 用肝素可使促甲状腺激素降低。
• 正常参考值：0.27～4.20uIU／mL
化学发光分析
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发
光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为 化学发光分析。
化学发光分析优点
• 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发
光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响 有很高的灵敏度，
• 并且不像放射分析那样存在环境污染和健康危
害
化学发光分析缺点
• 参考值：0.00-115.00IU/ml
异常值处理：
• TSH>10uUI/ml 时应进行1：10稀释重做。 • TPO>600IU/ml时应进行1：5稀释重做。
• 出现单个项目过高或过低时，按处理异常结果
流程寻找原因。
象，比如萤火虫的发光，反应底物荧光 素在荧光素酶的催化下利用ATP产能， 生成激发态的氧化荧光素，后者在回复 到基态时多余的能量以光子形式放出。 • 化学发光（生物体内各种现象都与化学 反应有关，都属于化学发光现象）
化学发光
• 化学发光是指伴随化学反应过程中所产生的光的发射
现象，某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物 由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当 其回到基态时以发射光子的形式释放能量。
降低：见于甲状腺功能减退。
正常参考值：2.0-4.4pg/ml
游离甲状腺素（FT4）
• 介绍：血清游离甲状腺素是甲状腺功能体外试验的灵敏指标，
即使在生理情况下引起血浆甲状腺素结合蛋白结合力和浓度 改变时，也能较准确反映甲状腺的功能。
• 临床意义：
增高：甲状腺中毒症、突眼性甲状腺功能亢进症、无痛 性甲状腺炎伴甲亢、亚急性甲状腺炎伴甲亢、甲状腺制 剂服用过量、甲状腺受体不应症、慢性甲状腺炎伴甲亢。
游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）
介绍：T3是由甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素。
FT3约占T3的0.5%,能透过细胞膜进入组织细胞，发挥 生理效应，其浓度与组织中的三碘甲状腺原氨酸浓度 一致，也与机体代谢状态一致，对非甲状腺疾病也有 诊断价值。
临床意义：
增高：见于甲亢、三碘甲状腺原氨酸型甲状腺功能 亢进。
免疫学检测历史演进
• 放射免疫检测（现Βιβλιοθήκη Baidu普遍使用于县级以上医
院）；
• 酶联免疫检测（各临床机构普遍使用）； • 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测
技术
发光分类
• 光照发光:发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激
发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光（荧光）。
• 生物发光：指发生在生物体内的发光现
总甲状腺激素(TT4)：
• 介绍：TT4是甲状腺分泌的主要产物，也是构成下丘脑-垂体
前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成份。TT4测定可用 于甲亢、原发性和继发性甲减的诊断以及TSH抑制治疗的监测。
• 临床意义：
增高：甲亢，急性甲状腺炎，亚急性甲状腺炎，急性肝炎，肥 胖症，应用甲状腺激素时，进食富含甲状腺激素的甲状腺组 织等。 降低：甲减，全垂体功能减退症，下丘脑病变，剧烈活动等。
化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。
化学发光免疫分析
（CLIA）
• CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一
种新的免疫分析技术。
• 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的
高度特异性。
化学发光免疫分析（ CLIA）分 类
• 按标志物的不同及反应原理的不同分为
• 直接化学发光免疫分析 • 化学发光酶免疫分析 • 电化学发光免疫分析
电化学发光
• 电化学发光（ECL）是通过在电极上施加一定
的波形电压或电流信号进行点解反应的产物之 间或与体系中共存组反应产生化学发光的现象
电化学发光剂
• 定义:指通过在电极表面进行电化学反应而发出
光的物质
• 特点： • 反应在电极进行 • 化学发光剂：三联吡啶钌 • 电子供体为：三丙胺
电化学发光免疫分析法
11月 刘博
• 免疫分析法 • 发光和化学发光 • 化学发光免疫分析法 • 电化学发光 • 电化学发光免疫分析法 • 甲状腺功能介绍
免疫分析
• 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种
手段；
• 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏
感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上， 通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系 统中抗原或抗体的性质与含量。
• 感染性疾病:衣原体抗体、弓形虫抗体、
风疹病毒抗体等
• 其它
• 如一些心脏标志物、病毒标志物、治疗药物
的监测等
甲状腺功能项目： 促甲状腺素（TSH）、 游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、 游离甲状腺素(FT4)、 三碘甲状腺原氨酸（T3）、 甲状腺素（T4）、 抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-TG)、 抗甲状腺过氧化物酶抗体（Anti-TPO) 。
血液后可刺激机体产生Anti-TG抗体。 Anti-TG，测定 有助于诊断自身免疫疾病。
• 临床意义：在自身免疫性甲状腺炎患者中可发现AntiTG抗体浓度升高出现频率大约是70%-80%。Graves 病Anti-TG抗体的阳性率约60%，经治疗后滴度下降提 示治疗有效。甲亢病人测Anti-TG阳性且滴度较高，提 示抗甲状腺药物疗效果不佳，且停药后易复发。
总三碘甲状腺原氨酸(TT3)：
• 介绍：10%～20%T3由甲状腺合成与释放，80%～90%来自于周围组
织T4的脱碘转化成T3。T3为主要发挥生物活性的甲状腺激素。血清 中T3的绝大多数(99.5%)与血浆中特异蛋白结合，仅极少数处于游离 状态(0.5%)。血清中TT3浓度的改变，表示甲状腺功能的异常，TT3 浓度的改变常和TT4平行，但有时存在差异，如T4型甲亢，TT3则正 常。因此，临床上常同时测定TT3和TT4值。
• 正常参考值：5.10-18.00ug/dl
抗甲状腺过氧化物酶自身抗体 （TPOAb） ：
介绍：甲状腺过氧化物酶是甲状腺微粒体的主要抗原成分，其功能与甲状 腺素的合成有关。抗甲状腺过氧化物酶抗体或抗甲状腺微粒体抗体可能使 甲状腺细胞损伤。检测抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法与抗甲状腺球蛋白 抗体类似。测定抗甲状腺过氧化物酶抗体的临床意义与抗甲状腺球蛋白抗 体也大致相同，主要对于慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进症、 原发性甲状腺功能减退症，有辅助诊断、疗效考核价值。 临床意义：
• 临床意义： • 增高：TT3是诊断甲状腺功能亢进(甲亢)最灵敏的指标，甲亢时TT3
可高出正常值4倍；同时TT3是诊断T3型甲亢的特异性指标。
• 降低：常见于甲状腺功能减低(甲减)。 • 正常参考值：血清TT3值与年龄有关，出生后TT3水平高于正常成人，
5岁后随年龄增长逐渐下降，老年人TT3常低于正常人。成人： 0.73～2.88ng/ml。
降低：甲状腺功能减退(原发性)、垂体性或者无痛性亚急 性甲状腺炎的一过性功能减退期、低白蛋白血症。
• 正常参考值：0.93～1.70ng／dL
促甲状腺激素（TSH）：
• 介绍：促甲状腺激素是腺垂体分泌的促进甲状腺的生长和
机能的激素，具有促进甲状腺滤泡上皮细胞增生、甲状腺 激素合成和释放的作用。
• 临床意义：
桥本(Hashimoto)甲状腺炎患者血清中ATG检出率可达90%～95%;甲状 腺功能亢进患者检出率40%～90%不等，检出率高的可能与部分病例属 于桥本甲亢有关;原发性甲状腺功能低下症患者检出率65%左右。
参考值：0.00-34.00IU/mL
抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-TG)
• 介绍：甲状腺球蛋白是一种潜在的自身抗原，当进入
ECLIA特点
• 三联吡啶钌在电场中不断得到电子，可持续发
光，信号强度高，容易测定容易控制 不影响标志物的理化特性
• 三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，
• 试剂灵敏度高，稳定性好
ECLIA优越性
• • • •
高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂灵敏度高，稳定性好，无毒害，无污染，有效期 长，达数月甚至数年。
电化学发光免疫分析 （ECLI)
• ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧
光免疫技术之后的新一代标记免疫测定技术；
• ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物； • ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。
ECLI原理
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，
用电化学发光剂三联吡啶钌标记Ab(Ag),通过AgAb反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量或定性 分析。
• 操作简单，耗时短，易于自动化。
临床应用
• 由于该技术无放射性污染，同时有放射免疫测 • • • •
定的灵敏度，且具有快速、准确、特异、可自 动化等特点，广泛应用于以下几个方面: 激素:甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质 激素 肿瘤标记物:AFP、CEA、PSA、CA199、CA125、 CA153等 贫血因子:VB12、叶酸、铁蛋白、转铁蛋白等 糖尿病:胰岛素、血清C-肽、血浆胰高血糖素等
增高：原发性甲状腺功能减退、伴有甲状腺功能低下的桥 本病、亚急性甲状腺炎恢复期。摄人金属锂、碘化钾、促 甲状腺激素释放激素可使促甲状腺激素增高。 降低：垂体性甲状腺功能低下、非促甲状腺激素瘤所致的 甲状腺功能亢进，以及摄入阿司匹林、皮质激素及静脉使 用肝素可使促甲状腺激素降低。
• 正常参考值：0.27～4.20uIU／mL
化学发光分析
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发
光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为 化学发光分析。
化学发光分析优点
• 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发
光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响 有很高的灵敏度，
• 并且不像放射分析那样存在环境污染和健康危
害
化学发光分析缺点
• 参考值：0.00-115.00IU/ml
异常值处理：
• TSH>10uUI/ml 时应进行1：10稀释重做。 • TPO>600IU/ml时应进行1：5稀释重做。
• 出现单个项目过高或过低时，按处理异常结果
流程寻找原因。
象，比如萤火虫的发光，反应底物荧光 素在荧光素酶的催化下利用ATP产能， 生成激发态的氧化荧光素，后者在回复 到基态时多余的能量以光子形式放出。 • 化学发光（生物体内各种现象都与化学 反应有关，都属于化学发光现象）
化学发光
• 化学发光是指伴随化学反应过程中所产生的光的发射
现象，某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物 由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当 其回到基态时以发射光子的形式释放能量。
降低：见于甲状腺功能减退。
正常参考值：2.0-4.4pg/ml
游离甲状腺素（FT4）
• 介绍：血清游离甲状腺素是甲状腺功能体外试验的灵敏指标，
即使在生理情况下引起血浆甲状腺素结合蛋白结合力和浓度 改变时，也能较准确反映甲状腺的功能。
• 临床意义：
增高：甲状腺中毒症、突眼性甲状腺功能亢进症、无痛 性甲状腺炎伴甲亢、亚急性甲状腺炎伴甲亢、甲状腺制 剂服用过量、甲状腺受体不应症、慢性甲状腺炎伴甲亢。
游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）
介绍：T3是由甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素。
FT3约占T3的0.5%,能透过细胞膜进入组织细胞，发挥 生理效应，其浓度与组织中的三碘甲状腺原氨酸浓度 一致，也与机体代谢状态一致，对非甲状腺疾病也有 诊断价值。
临床意义：
增高：见于甲亢、三碘甲状腺原氨酸型甲状腺功能 亢进。
免疫学检测历史演进
• 放射免疫检测（现Βιβλιοθήκη Baidu普遍使用于县级以上医
院）；
• 酶联免疫检测（各临床机构普遍使用）； • 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测
技术
发光分类
• 光照发光:发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激
发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光（荧光）。
• 生物发光：指发生在生物体内的发光现
总甲状腺激素(TT4)：
• 介绍：TT4是甲状腺分泌的主要产物，也是构成下丘脑-垂体
前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成份。TT4测定可用 于甲亢、原发性和继发性甲减的诊断以及TSH抑制治疗的监测。
• 临床意义：
增高：甲亢，急性甲状腺炎，亚急性甲状腺炎，急性肝炎，肥 胖症，应用甲状腺激素时，进食富含甲状腺激素的甲状腺组 织等。 降低：甲减，全垂体功能减退症，下丘脑病变，剧烈活动等。