全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
单分子荧光共振能量转移技术
研究生光谱技术与应用课程作业河南大学单分子荧光共振能量转移技术学生：郭爱宇学号：************学院：物理与电子学院年级专业：2012级光学工程课程名称：光谱技术及应用指导老师：郭立俊教授单分子荧光共振能量转移技术摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。
在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。
单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。
介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。
关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团1 引言光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。
在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。
而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。
2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。
主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。
由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。
标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。
荧光显微镜操作说明
一、荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。
它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。
是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50〜70个标准大气压力，这一过程一般约需5〜15min0超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。
它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。
超高压汞灯也散发大量热能。
因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太局O新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V）,启动后，维持工作电压一般为50〜60V,工作电流约4A左右。
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h,开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min,则寿命降低50%。
因此，使用时尽量减少启动次数。
灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。
灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。
点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，•般需要等15min0由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
超高压汞灯（IOOw或200TV）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。
在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。
国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HB0-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h 以上，价格也比较低。
我国研制的一种简易轻便型高色温溟铝荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
7
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
8
TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
3
传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
11
TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
14
物镜型TIRFM系统
tirf显微镜原理
tirf显微镜原理简介：TIRF（Total Internal Reflection Fluorescence，全内反射荧光显微镜）是一种用于研究界面和薄膜附近的生物发光过程的高分辨率显微镜技术。
本文将解析TIRF显微镜的原理，包括全内反射现象、波导耦合和荧光检测等方面，帮助读者深入了解这种重要的显微镜技术。
正文：1. 全内反射现象TIRF显微镜利用全内反射现象实现高分辨率成像。
当光束从高折射率的材料（例如玻璃）射入到低折射率的材料（例如溶液）时，当入射角大于临界角时，光束将完全反射，不进入低折射率材料。
2. 波导耦合TIRF显微镜利用光波在玻璃和样品之间发生全内反射来实现荧光成像。
一种常用的方法是通过特殊设计的金属或玻璃叫做波导，将激光束耦合到玻璃和样品的边界上。
波导保证了光束以全内反射的方式沿界面传播，通过控制波导与样品之间的接触面积，可以使激光束只在非常薄的区域内与样品相互作用，实现高分辨率荧光成像。
3. 荧光检测TIRF显微镜利用荧光探针标记的样品发出的荧光信号来进行观察。
在TIRF成像中，仅有与表面接触的荧光染料将被激发并发射荧光。
未被激发的荧光将不被收集，从而有效地减少了背景信号的干扰，提高了信噪比和成像的分辨率。
4. 超分辨率成像TIRF显微镜在满足一定条件下能够实现超分辨率成像。
通过控制入射角度、荧光染料的位置和波导耦合等参数，可以限制荧光激发区域的大小，使得成像分辨率超越传统荧光显微镜的衍射极限，实现更高的空间分辨率。
5. 应用TIRF显微镜广泛应用于生物科学的研究领域，特别是细胞和分子生物学。
通过观察细胞膜和介观尺度结构之间的相互作用、细胞内分子交互作用以及染料的分子动力学等，TIRF显微镜为研究生命科学中的各种现象和过程提供了高分辨率的实时成像手段。
总结：TIRF显微镜利用全内反射现象和波导耦合技术，实现了高分辨率的成像和荧光检测。
通过限制光激发区域和减少背景干扰，TIRF显微镜能够提供超过传统荧光显微镜的分辨率。
全内反射荧光成像基本原理
hv H**
H hv
S2
吸
放
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
精品课件
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
精品课件
全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
精品课件
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
精品课件
精品课件
隐失波强度成指数衰减曲线
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
精品课件
当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
TIRFM原理及应用
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
02.1 全反射
1. 2.
snell定律: n1sin θ 1=n2 sin θ 2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
02.2 隐失波
1.
如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33（生物细胞的折 射率范围是1.33-1.38），则玻璃／界面处的临界角为61.78°。从几 何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在剥离界面上完全反 射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能 量会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播。这部分光场就是所 谓的隐失波。
TIRFM在细胞生物物理研究中的应用
主讲人：秦继伟
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
01 TIRFM简介
全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反 射产生的隐失波激发样品,使样品表面数百纳米厚 的薄层内的荧光团受到激发，只有这个小范围内的 荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子 则完全不受影响。所以全内反射荧光显微术具有其 它成像方法无法比拟的高的信噪比，细胞的光损伤 和光漂白也很小。再用高灵敏度和高时间分辨率的 摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从 而实现对生物样品观测的一种技术。
正置荧光显微镜
倒置荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统的最大优点是在进行TIRFM实 验时可对样品进行其他操作，如改变样品介质、进行细胞显微注 射及微操作等。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
PC-linker
全内反射荧光显微术应用
现在全内反射荧光显微术已被泛广用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转 移( FRET) 、ATP 酶的翻转,聚合物内单 个分子的结构变化、以及等离子体膜附 近的神经分泌腺的颗粒运动等多方面。
全内反射荧光显微镜的发展展望
成像系统的消逝场 是通过入射光经物 镜本身全反射产生
棱镜型系统包括三个主要部分
(1) 倒置的相衬光学显微镜; (2) 可以二维精确移动的样品台; (3) 用来发生全反射的棱镜
棱镜型评价
1
棱镜型系统在实现上更加容易,它只 需要激光光源、棱镜和显微镜。
2
在探测上,它也不容易受到入射光信 号的干扰
3.全内反射荧光显微镜同原子 力显微镜结合的应用
Injected Fluorescent Beads
1) Silanization of whisker crystals 2) Modification of PC-linker 3) Immobilization of Fluorescent Beads
合适的pH值：PH:4.25
合适的TPPS的浓度：1.5x10-6 -1"L’
2.蛋白质的分泌：
A. 为刺激给予之前;B、C. 为刺激给予后 MIN6 细胞用吖啶橙荧光染料转染后给予50 mmol/ L 氯化钾 刺激,应用TIRFM 得到全反射影像
A1 为刺激给予之前;B、C1 为22mmol/ L 葡萄糖给予之后 MIN6 细胞应用吖啶橙荧光染料转染后给予高浓度葡萄糖刺激, 应用TIRFM 得到全反射影像。
放置样品的空间收到棱镜的限制
显微镜名词大全
徕卡独家设计-智慧型相位差影像，仅需使用一般明视野物镜(无须使用特定的相 位差物镜)，配合 A 或 C 菱镜，即可观察相位差影像， 如使用不同的 Light Ring， 可微调相位差对比程度。
环状光阑（Ring slit）
装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的 环形光阑装在一圆盘内，外面标有 10X、20X、40 X、100X 等字样，与相对应倍 数的物镜配合使用。
慧差(Coma)
慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜 后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点状，型 如慧星，故称“慧差”。
覆盖差
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片 进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差 ，这就是覆盖差。覆 盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为 0.17mm，许可范围在 0.16-0. 18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计 算在内。物镜外壳上标的 0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。
带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective）
在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑，外方也可以旋转的调节环，转动时可调节光 阑孔径的大小，这种结构的物镜是高级的油浸物镜，它的 作用是在暗视场镜检 时，往往由于某些原因而使照明光线进入物镜，使视场背景不够黑暗，造成镜检 质量的下降。这时调节光阑的大小， 使背景变黑，使被检物体更明亮，增强镜 检效果。
Booster lens
可以在不改变光路的前提下，增加放大倍数的光学组件。
CCIC
Constant Colour Intensity Control 恒定色温控制 是创新的透射光强度控制，此技术让显微镜维持精确恒定的固定色温。从此无须 再加入 ND 滤镜以补偿色温。有了 CCIC 设计在利用数 码相机取像時，无论太暗 或太亮的照明，皆无须利用 ND 滤镜或利用 WhiteBalance 来调整取像品质。
全内反射荧光显微镜剖析
隐失波
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻 璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于 波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中， 是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而 振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。
2.3全内反射荧光显微镜特点
①信噪比高（相对共聚焦显微镜） ②分辨率高（相对其他的光学显微镜） ③对生物样本损伤小，可以进行活体物质的研究
和单分子的动态研究。 ④全内反射的荧光激发深度只在～100 nm 的薄
层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化 学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成 像技术。 ⑤全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像, 大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求。
5. 在生物单分子研究中的应用
细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信 号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞 表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表 面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深 层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来 说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧 光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激 发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成 为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单 分子动力学的最有前途的光学成像技术。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
初级感觉神经元的分泌和胞吞：单个囊泡行为的全内反射显微成像(TIRFM)研究
初级感觉神经元的分泌和胞吞：单个囊泡行为的全内反射显微成像（TIRFM）研究位于背根神经节（DRG）的初级感觉神经元表达多种神经肽，这些神经肽从神经元的末梢和胞体等区域的致密囊泡（DCV）分泌出来，起到调节神经元突触传递，细胞兴奋性和调控基因表达等重要作用。
分泌过程是神经肽行使其功能的重要调节步骤，然而以往对于这一过程的研究主要在神经内分泌细胞上进行，对神经元神经肽分泌多采用生化方法检测，不足以阐明这一精细调控的过程。
因此我们采用实时成像的方法对DRG神经元神经肽分泌的调控进行了研究。
在此过程中，我们还意外地发现了一个内吞的负向调控因子，于是我们进一步对其作用机制进行了研究。
本论文将分别对这两部分工作进行介绍。
第一部分研究DRG神经元神经肽分泌的调控。
我们首次将全内反射荧光显微镜（TIRFM）成像应用于DRG神经元，用NPY‐pHluorin作为分子标记，在单个囊泡水平观察刺激引起的神经肽分泌。
TIRFM 记录到的单囊泡分泌事件有NPY‐pHluorin“完全释放型”和“不完全释放型”两种，提示DRG神经元中神经肽的分泌受到融合小孔（fusion pore）的调节。
对胞体和轴突的同时记录发现，除了我们已知的胞体分泌，DRG神经元的轴突各部分也存在刺激依赖的DCV分泌，两者对于刺激的响应均表现出较长的延迟。
去极化及电刺激引起的轴突囊泡分泌的数量显著多于胞体，分泌时程也显著快于胞体，尽管轴突的内钙浓度并不比胞体更高，说明DCV在不同细胞区域的分泌位点受到严格的调控。
然而激活DRG神经元上的温度敏感通道TRPV1引起的神经肽分泌在轴突和胞体间没有明显的差异，其单个事件的动力学与去极化引起的分泌有显著的不同，有更多的不完全释放型的事件发生。
这一发现表明不同的生理刺激可以对分泌的位点和融合小孔进行调节，进而调节递质的分泌。
第二部分研究DRG神经元内吞的调控机制。
内吞过程的精确和有效的调控对于突触传递，细胞膜平衡，细胞膜表面的通道和受体的平衡等都具有重要的作用。
全内反射荧光显微镜_单分子荧光能量共转移_
全内反射荧光显微镜单分子荧光能量共转移1. 引言1.1 概述本文旨在介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术，并探讨它们在生物医学领域的应用。
全内反射荧光显微镜是一种基于全内反射现象的高分辨率显微镜，可以实现非常高的空间分辨率和极低的背景噪音，因此被广泛应用于生物体系中超分辨率成像的研究。
而单分子荧光能量共转移是一种用来研究生物体系中分子之间相互作用和结构动态变化的方法，在生命科学领域具有重要意义。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分：引言、全内反射荧光显微镜、单分子荧光能量共转移、实验结果与讨论以及结论。
在引言部分，我们将对本篇文章进行简要介绍，并概述全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的背景和意义。
随后，在接下来的几个部分，我们将逐步深入探讨这两项技术的原理、发展历程、应用领域以及实验方法与技术要点。
最后，我们将介绍相关的实验结果，并进行结果讨论与解释。
在结论部分，我们将对本文进行总结回顾，并探讨存在的问题及未来展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的原理和应用，并通过实验结果与讨论来验证这两项技术在生物医学领域中的有效性。
通过本文的阐述，读者可以了解到这些重要技术在研究生物体系中起到的关键作用，并对未来发展方向有所启示。
2. 全内反射荧光显微镜部分的内容如下：2.1 原理介绍全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的高分辨率荧光显微技术。
其原理是利用高折射率物质与低折射率域之间的全内反射现象，将激发光只聚焦在非常薄的表面层上，进而使得观察对象处于极低背景的强照射区域。
相比传统荧光显微镜，TIRFM 具有更高的信噪比和更好的空间分辨率。
在TIRFM中，通过特定角度入射到玻璃-样品界面上的激发光会被全内反射。
当样品中存在荧光探针时，这些探针会受到入射激发光的刺激并发生荧光发射。
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜（TIRFM）系统全内反射荧光显微镜TIRFM系统介绍一、全内反射荧光显微镜的原理及其在生物领域的应用全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope TIRFM)利用光从高折射率的介质进入较低折射率的介质时，如果入射角足够大时则光全部被反射而不发生折射，但是在两种介质的界面会产生衰逝波可以激发近界面100nm范围内的荧光的原理来实现对物体表面的观察。
可通过常规荧光显微镜的照明器或特殊照明器送入激发光，并对激光的入射角度进行控制，采用瞬间场激发方法以避免激发光进入探测器，在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的。
为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。
这可以通过棱镜(prism)实现，称为prism-based TIRFM，也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为objective-type TIRFM。
现在商品化的全内反射荧光显微镜一般都是物镜类型的，速度快，精度高。
Wide field FL TIRFM全内反射荧光显微镜由于能实现物体表面非常薄范围内（小于100nm）荧光观察，故在某些生物领域得到广泛应用。
如以下等应用：1、细胞表面图象的观察。
如细胞膜表面结构，细胞表层的接触，膜表面动力学/蛋白质定位Fixed 3T3 纤维原细胞细胞免疫化学标记微管蛋白2、单分子观察及其操作。
肌球蛋白，肌动蛋白与Cy3标记ATP3、细胞膜表面运动。
如泡吞、泡吐现象，泡外分泌现象。
表达GFP-肌动蛋白的培养MAST 细胞正在胞饮4、细胞膜钙火花现象的观察，离子通道监视G蛋白偶联钙离子通道监视5、分子马达研究旋转的马达、细胞骨架蛋白、聚合体、G蛋白、环状蛋白、核苷酸马达RNA聚合酶反应除了在生物领域外，在化学领域等对于化学分子结构观察中也有很好的应用。
二、全内反射荧光显微镜的基本组成全内反射荧光显微镜主要由四部分组成。
显微镜名词大全
ICSI
Intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子显微注射，就是利用一根 显微注射针将一条精子直接注射到卵子中。
IMC ( Integrated Modulation Contract )
徕卡独家设计-智慧型干涉对比影像，仅需使用一般明视野物镜(无须使用特定的 干涉物镜)，配合 A 或 C 菱镜，即可观察干涉对比影像 ，可微调对比程度。
二个相同的物镜，以一个小角度沿光轴排列，产生二个单独的图象。通过单独的 接目镜进行观察，它们合并起来形成一个 3-维图象。优 点是：价格低，体积小， 基本仪器具有较高的光学性能。
光漂白(Photobleaching)
指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消 失的现象。荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度 ，提高激发光强度 固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度 超过一定限度时，光吸收就趋于饱和， 并不可逆地破坏激发态分子，这就是光 漂白现象。
2004年蔡司公司又在传统柯勒式照明基础上推出了带有反光碗的全系统复消色差照明技术消除照明色差增强光的还原性进而提高分辨率同时照明均匀而光效高连续变倍体视显微镜zoomstereomicroscope这种体视镜的光学结构是由一个共用的初级物镜对物体成像后的两光束被两组中间物镜变焦镜分开并成一体视角再经各自的目镜成像它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的
HCS
Harmonic Component System Leica 专利的光学系统。它为整个光学系统中可能 包含的部分提供了一个统一的光学修正，这使得整个系统在保持原有功能的同 时， 可以根据要求不断的添加新的附件，以实现新的功能。
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4.吸附
• 用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分
子吸附行为 。
全内反射荧光显微镜下拍到 的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图
分别在全内反射荧光显微镜下（左）和 一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,细 胞。
• 全内反射荧光显微镜（TIRFM）是研究紧贴固体
隐失波的强度-深度图
荧光激发原理
T12（θi）- 分界面处的透射强度 θi - 入射角 d 12 - 渗透深度 λ - 入射光波长
透射强度和浸透深度公式
对于可见光波长 380 ～ 780nm而言， 浸透深度为～ 100nm。
箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。 黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点表示未被激发的荧光分子。
• 全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优
势(它的荧光激发深度只在～100 nm 的薄 层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生 物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。
• 全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成
像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像 的要求;另一方面它的图像解释相对于近场, 干涉显微成像来说也较简单。
荧光激发原理
snell定律:
n1sin θ1=n2 sin θ2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
荧光激发原理
非均匀波
沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数衰减。
1. 全内反射荧光显微术 在生物单分子科学中的应用
• 单分子荧光探测主要有三个问题： • （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱
的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。 • （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光 等产生的背景光，极大的干扰了信号光的 探测。所以应该尽量降低背景激发光。 • （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景 光。
CCD相机的快速成像特点提 高了其时间分辨率，使得观察单分 子的运动、细胞物质的分泌、蛋白 质的相互作用成为可能并成为这方 面的优势观察仪器。 CCD相机的高灵敏度特点使 全内反射荧光显微镜利用消逝波照 射样品并使其成像成为可能，也成 就了其高信噪比。
CCD相机
当对活细胞 成像时,为了 达到单分子 级的灵敏度 或是为了减 少曝光时间, 需要采用图 像增强器。
全内反射荧光显微镜
发展与展望
优势应用
分型及结构
基本原理
发展历史
发展历史
荧光显微镜的概念
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。
发展历史
3.离子通道研究
• 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜
• •
调节离子电流和电化学势。 单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方 法来检测各种通道的电特性。 目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信 号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到 平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微 镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展 的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到 离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用， 同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。
解依荻
全内反射应用的核心问题
全内反射应用的核心问题是
制作与电子显微术（EM）切 片尺寸相当的光学切片。
共焦技术 VS.全内反射技术
共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深 度分别为～500－800nm。 全内反射显微术: 典型的垂直照明深度 <100nm。 结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。
构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光 显微术。 • 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白， 然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光 基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象， 说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。
2.蛋白分子相互作用
• 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反
射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接 观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 • 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(cochaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相 互作用已经在单分子水平进行了很好的研 究。 • 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平 生物大分子相互作用的成像。
全内反射的应用比较
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和双光子激光扫描显 微镜（TPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。 CLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集 光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦） 可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它 地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大 约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄 层的厚度（200nm）。
平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固 体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数 性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对 结果的解释具有一定的困难性。 因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技 术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。
•
The application of the total internal reflection fluorescence microscopy
目前使用CCD 探测, 可达到的量子产率 已到～80 % ,成像 速率～200 Hz.
全内反射显微镜的分型及其结构
全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型
两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。
（一）棱镜型全内反射荧光显微镜
利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。
这些问题都可以利用全内反射荧光显微成 像系统来解决
全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的 过程进行观测，而不受到来自细胞内深层 区域信号的干扰。
全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学 如生物化学动力学、单分子动力学的最有 前途的光学成像技术
利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。
• 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态
二者比较
棱镜型全内反 射荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜
05级医学实验 宋一萌 90513111
பைடு நூலகம்
• 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生
的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。 • 当今世界上研究单分子科学最具前途的新 型生物光学显微技术之一 • 可用来实现对单个荧光分子的直接探测。
90年代 20 新型物镜透镜、聚光 世 镜和超灵敏探测器的 纪 出现，使TRIFM技术
得到充分发展。
Axelrod等生物物理 20 学家对TRIFM技术 世 及基本原理进行描 纪 述，并探索了其生 物应用。
80年代早期
1965年
Hirsch field
完成了 第一个 全内反射 荧光实验
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
评价
棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。
在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。
放置样品的空间受到棱镜的限制。
（二）物镜型全内反射显微镜
收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜
发生全内反射的光学器件。
由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 , 因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为： NA = nsin（u/2） nsin（u/2） > nsinθc NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的 折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全 反射的临界角。
TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如 细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。
生物单分子荧光检测技术的比较
共聚焦激光扫描显微 （CLSM） 双光子激光扫描显微 镜（TPLSM） TPLSM对生物系统和 体内细胞性质具有高 的分辨率。双光子激 发能探索活细胞内各 种分子的实时动态， 能实现在样品中的高 度精确定位。减少了 光损伤，特别对需要 条件温和的生物体系 有利 全内反射荧光显微 镜（TIRFM） TIRFM具有高度的 界面（表面）特异 性，可有效排除本 体干扰，获取界面 信息。纵向分辨力 极高，特别适用于 表面或界面单分子 的测定。全内反射 荧光法相对简单， 费用低廉。表面 或界面单分子的测 定
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM）
全内反射的应用比较
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全 反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分 子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围 通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性， 只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大 大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛 应用于细胞表面物质的动态观察。
• 现在全内反射荧光显微术已被广泛用于
• • • • •
实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动