现代分子生物学第五章课件
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5 分子生物学研究方法(上)
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组学及其研究技术
名词： 生物技术、基因工程、生物工程、蛋白质组学、生物芯片、RNA 干扰、 基因敲除技术、大规模克隆技术、遗传多态性：SNP、RFL P、…
英文影印版/中文版
发酵
大规模利
上
用酵母
千
十
百度文库
1928，Flemming
年
九
青霉素
世
纪
Biotechnology
Karl Ereky (1917, Hungary) 甜菜饲料 --〉养猪 生物制品，初级发酵
1970s，DNA重组技术
重组DNA技术是现代生物技术的核心
分子操作 DNA技术 基因操作 遗传工程 基因工程
同义词
核心实验操作:
DNA分子的切割与连接、 分子杂交、凝胶电泳、 细胞转化、序列分析及人工合成、 PCR、定点突变
……
重组DNA技术:
体外构建重组DNA分子（重组子）：外源DNA + 载体 转化宿主细胞： 向宿主引入重组子 被转化宿主细胞(转化子)稳定遗传和表达新特性
意义和应用：DNA分子克隆；遗传修饰；特定产品表达
5.1 重组DNA技术回顾
理论基础： 1940s：DNA是遗传物质 1950s：DNA双螺旋结构 1960s：破译遗传密码、中心法则、操作子学说 1970s：DNA分子的切割与连接： 体外DNA重组
DNA分子操作的重要“工具”相继被发现直接推动了本领的发展： 1970，限制性核酸內切酶(Restriction Endonuclease, RE) 1967，DNA连接酶(Ligase) 1973，载体(Vector) 1970，宿主细胞(Host cell)
(1968). H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley isolated and characterized the first sequence
specific restriction nuclease.
1950S’ Phage growth restriction. 1960S’ Methylase and nuclease. Stewart Linn and Werner Arber isolated examples of the two types of RE. 1968, Site-specific nuclease. H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley,
Ref. to P156, T5-1
5.1.1限制性核酸内切酶
核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）：从核酸的末端一个接一个水解核苷酸； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸的链中间水解3’，5’磷酸二酯键， 将核酸分子切断。
限制性内切酶来自细菌内具有保护自身遗传物质稳定的限制修饰体系，该体 系一方面甲基化修饰自体的DNA，为自己所识别而不被内部限制酶水解。外来入 侵DNA没有所识别的标记，则被核酸内切酶水解。此体系具有修饰自己限制外来 的作用，限制性内切核酸酶由此得名，1963年在细菌中发现。
重要工具酶及其应用： 限制性核酸内切酶、连接酶、… 限制性内切核酸酶被发现的意义？ 限制-修饰系统？
参考书
1、生物化学与分子生物学实验技术 （面向21世纪教材）杨安钢等编 高教出版社 2、现代生物技术
瞿礼嘉等编 高教出版社 3、精编分子生物学实验指南 （第四版中译版） 科学出版社 4、基因克隆实验指南（第三版）
几个重要技术的原理和操作： DNA操作技术(包括基因克隆及相应的筛选鉴定和分析)、 RNA操作技术(分离纯化,特别是mRNA纯化/反转录, iRNA)、 PCR技术及PCR演生技术、凝胶电泳、分子杂交、 DNA文库的构建(g/cDNA library )、 定点突变技术\、基因表达分析技术、 DNA测序及自动化测序仪的原理、DNA足迹试验、 蛋白质-蛋白质互作、蛋白质-DNA互作的研究技术、 噬菌体展示技术
限制酶类型 根据结构,辅因子的需求，切位与作用方式，分为三种类型。
第一型限制酶（Type I） 多亚基，同时具有修饰及识别切割的作用；通常其切割位距离识别可达数千
个碱基之远。 需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶（Type II） 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。无需ATP和SAM。所识别
的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所 识别的序列。是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶（Type III） 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称
序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性核酸内切酶识别的DNA序列一般为4 ~ 8bp。 对于随机序列，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶
1970， Smith 和 Wilcox 在流感嗜血杆菌中分离纯化了 限制性内切酶Hind II； 1972 ，Boyer实验室发现核酸内切酶 Eco RI
DNA 酶学回顾
(1955), Arthur Kornberg and colleagues isolated DNA polymerase.
(1966), B. Weiss and C.C. Richardson isolated DNA ligase.
限制酶重要特点：
用于DNA分子的鉴定、识别、分析等。 用于异源DNA黏接重组 即：识别特定序列（多为回文序列）； 产生粘性末端（5’-P，3’-OH）； 产生特定的限制酶片断
6bp回文序列
限制性片段
平
平
限制性内切核酸酶的命名：
按酶的来源的属、种名而定。取属名的第一个字母与种名的头两个字母组 成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先 后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先 后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组学及其研究技术
名词： 生物技术、基因工程、生物工程、蛋白质组学、生物芯片、RNA 干扰、 基因敲除技术、大规模克隆技术、遗传多态性：SNP、RFL P、…
英文影印版/中文版
发酵
大规模利
上
用酵母
千
十
百度文库
1928，Flemming
年
九
青霉素
世
纪
Biotechnology
Karl Ereky (1917, Hungary) 甜菜饲料 --〉养猪 生物制品，初级发酵
1970s，DNA重组技术
重组DNA技术是现代生物技术的核心
分子操作 DNA技术 基因操作 遗传工程 基因工程
同义词
核心实验操作:
DNA分子的切割与连接、 分子杂交、凝胶电泳、 细胞转化、序列分析及人工合成、 PCR、定点突变
……
重组DNA技术:
体外构建重组DNA分子（重组子）：外源DNA + 载体 转化宿主细胞： 向宿主引入重组子 被转化宿主细胞(转化子)稳定遗传和表达新特性
意义和应用：DNA分子克隆；遗传修饰；特定产品表达
5.1 重组DNA技术回顾
理论基础： 1940s：DNA是遗传物质 1950s：DNA双螺旋结构 1960s：破译遗传密码、中心法则、操作子学说 1970s：DNA分子的切割与连接： 体外DNA重组
DNA分子操作的重要“工具”相继被发现直接推动了本领的发展： 1970，限制性核酸內切酶(Restriction Endonuclease, RE) 1967，DNA连接酶(Ligase) 1973，载体(Vector) 1970，宿主细胞(Host cell)
(1968). H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley isolated and characterized the first sequence
specific restriction nuclease.
1950S’ Phage growth restriction. 1960S’ Methylase and nuclease. Stewart Linn and Werner Arber isolated examples of the two types of RE. 1968, Site-specific nuclease. H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley,
Ref. to P156, T5-1
5.1.1限制性核酸内切酶
核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）：从核酸的末端一个接一个水解核苷酸； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸的链中间水解3’，5’磷酸二酯键， 将核酸分子切断。
限制性内切酶来自细菌内具有保护自身遗传物质稳定的限制修饰体系，该体 系一方面甲基化修饰自体的DNA，为自己所识别而不被内部限制酶水解。外来入 侵DNA没有所识别的标记，则被核酸内切酶水解。此体系具有修饰自己限制外来 的作用，限制性内切核酸酶由此得名，1963年在细菌中发现。
重要工具酶及其应用： 限制性核酸内切酶、连接酶、… 限制性内切核酸酶被发现的意义？ 限制-修饰系统？
参考书
1、生物化学与分子生物学实验技术 （面向21世纪教材）杨安钢等编 高教出版社 2、现代生物技术
瞿礼嘉等编 高教出版社 3、精编分子生物学实验指南 （第四版中译版） 科学出版社 4、基因克隆实验指南（第三版）
几个重要技术的原理和操作： DNA操作技术(包括基因克隆及相应的筛选鉴定和分析)、 RNA操作技术(分离纯化,特别是mRNA纯化/反转录, iRNA)、 PCR技术及PCR演生技术、凝胶电泳、分子杂交、 DNA文库的构建(g/cDNA library )、 定点突变技术\、基因表达分析技术、 DNA测序及自动化测序仪的原理、DNA足迹试验、 蛋白质-蛋白质互作、蛋白质-DNA互作的研究技术、 噬菌体展示技术
限制酶类型 根据结构,辅因子的需求，切位与作用方式，分为三种类型。
第一型限制酶（Type I） 多亚基，同时具有修饰及识别切割的作用；通常其切割位距离识别可达数千
个碱基之远。 需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶（Type II） 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。无需ATP和SAM。所识别
的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所 识别的序列。是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶（Type III） 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称
序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性核酸内切酶识别的DNA序列一般为4 ~ 8bp。 对于随机序列，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶
1970， Smith 和 Wilcox 在流感嗜血杆菌中分离纯化了 限制性内切酶Hind II； 1972 ，Boyer实验室发现核酸内切酶 Eco RI
DNA 酶学回顾
(1955), Arthur Kornberg and colleagues isolated DNA polymerase.
(1966), B. Weiss and C.C. Richardson isolated DNA ligase.
限制酶重要特点：
用于DNA分子的鉴定、识别、分析等。 用于异源DNA黏接重组 即：识别特定序列（多为回文序列）； 产生粘性末端（5’-P，3’-OH）； 产生特定的限制酶片断
6bp回文序列
限制性片段
平
平
限制性内切核酸酶的命名：
按酶的来源的属、种名而定。取属名的第一个字母与种名的头两个字母组 成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先 后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先 后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。