现代分子生物学第五章课件
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《现代分子生物学》第五章 1 转录
表 12-1 E.coli RNA Pol 的结构和功能 亚基 基因 分子量 数目 组分 可能的功能 （KDa） α rpoA 40 2 核心酶 酶 组 装 及 与 调 节 蛋白作用 β rpoB 155 1 核心酶 和底物（核苷酸） 结合 β ’ rpoC 160 1 核心酶 模板结合 ω 10 1 核心酶 σ rpoD 70 1 σ 因子 和启动子结合， 识 别模板链 参照 B. Lewin:《GENES》Ⅴ.1994, Table 14.1 14.2
转录过程中，DNA双链中的一条链为模板链 （template/antisense strand ），而另一条链为 编码链（coding/sense strand）。
转录起始于RNA聚合酶和启动子(promoter) 结合之后，转录起始的第一个碱基称为转录 起始点(start point) 。在RNA聚合酶的作用下 合成RNA，至终止子(terminator)终止。 由启动子到终止子之间的序列称为转录单位 (transcription unit)。转录起始点前面的序列 称为上游(upstream)，后面的序列称为下游 (downstream)。
亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启 动子。另外， 亚基还参与RNA聚合酶与 一些转录调控因子间的作用。 亚基具有与底物（NTP及新生的RNA链） 结合的能力。利福霉素可以阻断转录的起 始，链霉溶菌素可抑制延伸反应，二者均 是通过与亚基的结合而发挥作用的。
’亚基可能与模板结合。 肝素可与’亚基结合而抑制转录，并且可 以和’亚基竞争DNA的结合位点。 亚基和’亚基提供了RNA聚合酶的活性 中心，其一级结构与真核生物RNA聚合酶 大亚基有同源性。 亚基的功能是帮助全酶识别启动子并与之 结合。 亚基也可被看作一种辅助因子，因 此又可称为因子（ Sigma factor）。
2024版年度现代分子生物学(全套课件180P)ppt课件
2024/2/3
链的延伸
RNA聚合酶沿DNA模板 移动，催化RNA链的延
伸。
转录终止
RNA聚合酶在特定信号 作用下停止转录，释放
RNA链。
16
转录后修饰
包括5’端加帽、3’端 加尾等修饰过程。
RNA的加工与成熟
剪接
去除内含子，连接外显子，形成成熟的 mRNA。
编辑
对某些核苷酸进行修饰或替换，改变RNA的 编码信息。
DNA复制和修复过程中的突变 和重组为生物进化提供了原材
料。
疾病发生与发展
DNA复制和修复异常可能导致 基因突变和基因组不稳定，进
而引发疾病的发生和发展。
2024/2/3
14
04
RNA转录与加工
2024/2/3
15
RNA转录的过程与机制
转录起始
RNA聚合酶与DNA模板 结合，形成转录起始复
合物。
疗。
基因治疗
通过导入正常基因或修复突变基 因，恢复细胞功能，达到治疗疾
病的目的。
精准医疗
结合基因诊断与治疗，为患者提 供定制化的治疗方案，提高治疗
效果和生活质量。
2024/2/3
26
07
分子生物学技术与应用
2024/2A重组技术
利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶，实现 DNA片段的切割、连接和重组，构建重组DNA分子。
8
基因组的组成与特点
基因组的定义
基因组是一个生物体所有 基因的总和，包括核基因 组和细胞器基因组。
2024/2/3
基因组的组成
基因组由DNA序列、RNA 序列和蛋白质序列等组成， 其中DNA序列是主要的遗 传物质。
基因组的特点
链的延伸
RNA聚合酶沿DNA模板 移动，催化RNA链的延
伸。
转录终止
RNA聚合酶在特定信号 作用下停止转录，释放
RNA链。
16
转录后修饰
包括5’端加帽、3’端 加尾等修饰过程。
RNA的加工与成熟
剪接
去除内含子，连接外显子，形成成熟的 mRNA。
编辑
对某些核苷酸进行修饰或替换，改变RNA的 编码信息。
DNA复制和修复过程中的突变 和重组为生物进化提供了原材
料。
疾病发生与发展
DNA复制和修复异常可能导致 基因突变和基因组不稳定，进
而引发疾病的发生和发展。
2024/2/3
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04
RNA转录与加工
2024/2/3
15
RNA转录的过程与机制
转录起始
RNA聚合酶与DNA模板 结合，形成转录起始复
合物。
疗。
基因治疗
通过导入正常基因或修复突变基 因，恢复细胞功能，达到治疗疾
病的目的。
精准医疗
结合基因诊断与治疗，为患者提 供定制化的治疗方案，提高治疗
效果和生活质量。
2024/2/3
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07
分子生物学技术与应用
2024/2A重组技术
利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶，实现 DNA片段的切割、连接和重组，构建重组DNA分子。
8
基因组的组成与特点
基因组的定义
基因组是一个生物体所有 基因的总和，包括核基因 组和细胞器基因组。
2024/2/3
基因组的组成
基因组由DNA序列、RNA 序列和蛋白质序列等组成， 其中DNA序列是主要的遗 传物质。
基因组的特点
分子生物学第5章、第6章
•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为 遗传重组，或基因重排。→ 重组DNA •真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染 色体之间的交换；细菌及噬菌体的基因组为单倍体， 来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传 重组。 •DNA重组对生物进化起着关键的作用。 •重组分类：同源重组(homologous recombination) 、 位点特异性重组(site-specific recombination)、 转座重组(transposition recombination)和 异常重组(illegitimate recombination)。
1. 互变异构体：碱基发生烯醇式-酮式互变异构或者氨 基-亚氨基互变异构时，使碱基错配。 2. 脱氨基作用：碱基上氨基自发脱落，或在诱变剂的 作用下脱去氨基，则C→U、A →I、G →X，引起子 链错误。 3. DNA聚合酶“打滑”：DNA复制时发生碱基的环出现 象，引起一个或数个碱基的插入或缺失，易发生于 几个相同碱基串联的部位。 4. 活性氧（O3）引起的诱变：①氧化碱基与C、A配对， 造成GC → TA颠换，这种损伤可以积累；②H2O2造成 的DNA氧化损伤，此类损伤一般能被修复。
核苷酸切除修复
错配修复
错配修复对 DNA复制忠实 性的贡献力达 102-103，DNA 子链中的错配 几乎完全都被 修正，充分反 映了母链的重 要性。
大肠杆菌甲基化引 导的错配修复
重组修复
易错修复和SOS反应
•SOS反应：当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而
诱发出一系列复杂的反应。
•这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。
5.3.4 基因突变的后果
基因突变的后果主要是生物功能的丧失。 某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活， 有时还会引起多种酶的缺乏。 有些突变可产生功能获得性显性表现型。 典型的人体细胞突变每个基因每代发生率为107～10-5，但并非所有的突变都会导致疾病。
现代分子生物学ppt课件
• 翻译后的转运机制：细胞膜受体 • 核定位蛋白的转运机制：核定位序列 • 蛋白质的降解：蛋白酶水解、N端氨基酸影
响半衰期
第五章 分子生物学研究方法
知识要点
• 分子克隆技术的过程 • 分子杂交的概念 • PCR反应步骤
分子克隆RE、ligase • 重组DNA分子导入寄主细胞：细菌转化 • 重组体克隆的筛选：蓝白斑筛选、抗生素
第四章 生物信息的传递（下）
知识要点
• 三联体遗传密码 • tRNA的结构与功能 • 核糖体的结构与功能
• 蛋白质合成机制 • 蛋白质转运机制
遗传密码
• 遗传密码的破译 • 遗传密码的特性：无逗号、不重叠、通用
性、简并性、起始密码和终止密码
tRNA的结构与功能
• tRNA的二级结构：三叶草型——四环四臂 • tRNA的三级结构：倒L型 • tRNA的功能：密码子与反密码子的配对 • tRNA种类：起始tRNA与延伸tRNA、同工
C值矛盾
DNA结构
• DNA的一级结构 • DNA的二级结构——双螺旋模型
影响DNA二级结构稳定的因素 • DNA的高级结构——正超螺旋和负超螺旋
DNA复制
• 半保留复制 • 半不连续复制 • 复制的起点、方向和速度 • DNA聚合酶：原核 真核 • 原核生物和真核生物DNA复制的差别
第三章 生物信息的传递（上）
知识要点
• RNA转录过程和转录后加工 • 启动子与增强子、终止与抗终止 • 原核生物与真核生物mRNA的特征比较
RNA转录过程
• 不对称转录 • 原核生物RNA聚合酶：核心酶＋因子 • 真核生物RNA聚合酶：分类、特征、转录
产物 • 起始（启动子）、延伸、终止（终止信号）
原核与真核启动子的特征 增强子的概念和作用特点 终止和抗终止
响半衰期
第五章 分子生物学研究方法
知识要点
• 分子克隆技术的过程 • 分子杂交的概念 • PCR反应步骤
分子克隆RE、ligase • 重组DNA分子导入寄主细胞：细菌转化 • 重组体克隆的筛选：蓝白斑筛选、抗生素
第四章 生物信息的传递（下）
知识要点
• 三联体遗传密码 • tRNA的结构与功能 • 核糖体的结构与功能
• 蛋白质合成机制 • 蛋白质转运机制
遗传密码
• 遗传密码的破译 • 遗传密码的特性：无逗号、不重叠、通用
性、简并性、起始密码和终止密码
tRNA的结构与功能
• tRNA的二级结构：三叶草型——四环四臂 • tRNA的三级结构：倒L型 • tRNA的功能：密码子与反密码子的配对 • tRNA种类：起始tRNA与延伸tRNA、同工
C值矛盾
DNA结构
• DNA的一级结构 • DNA的二级结构——双螺旋模型
影响DNA二级结构稳定的因素 • DNA的高级结构——正超螺旋和负超螺旋
DNA复制
• 半保留复制 • 半不连续复制 • 复制的起点、方向和速度 • DNA聚合酶：原核 真核 • 原核生物和真核生物DNA复制的差别
第三章 生物信息的传递（上）
知识要点
• RNA转录过程和转录后加工 • 启动子与增强子、终止与抗终止 • 原核生物与真核生物mRNA的特征比较
RNA转录过程
• 不对称转录 • 原核生物RNA聚合酶：核心酶＋因子 • 真核生物RNA聚合酶：分类、特征、转录
产物 • 起始（启动子）、延伸、终止（终止信号）
原核与真核启动子的特征 增强子的概念和作用特点 终止和抗终止
分子生物学第5章
序列3、4不能形成衰减子结构，下游的结构基因可以被有效转 录
(2)当色氨酸充足时，色氨酰tRNA供给充足，核糖体迅速翻译序列1
合成前导肽，并对序列2形成约束，使序列2、3不能形成茎环结 构，转而序列3、4形成转录终止子结构衰减子，使下游正在转 录结构基因的RNA聚合酶脱落，终止转录
转录衰减机制:
新生肽链 核糖体
5’ 1 2
衰减子结构 (attenuator)
3
4
mRNA
UUUU 3’
DNA
trp 密码子当色氨酸来自度高时核糖体5’
1
2
3 4
当色氨酸浓度低时
高Trp时： Trp-tRNATrp 存在
核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2
片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖ρ因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物 转录、翻译偶联,产生前导肽
前导序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密码前一 个长162nt的mRNA片段。
第10和第11位上有相 邻的两个色氨酸密码子
转录与翻译的偶联是衰减调控的基础 色氨酰tRNA浓度的变化是衰减调控的信号
(1)当色氨酸缺乏时，色氨酰tRNA供给不足，合成前导肽的核糖体
停滞于序列1的色氨酸密码子位点，序列2、3形成茎环结构，使
结合乳糖、G存在与否及与操纵子正、负控因素、 基因开放与关闭情况如下：
葡萄糖（G） 乳糖 基因开放 基因关闭 机理简述（学生填充）
①
×
× √ √
√
× × √
√
√ √ √
CAP正控、乳糖去阻遏、基因开放、转录进行 不能诱导去阻遏，CAP即使结合，基因未开放 细菌优先用G，无CAP结合，无诱导去阻遏 CAMP-CAP复合物无，CAP位点空，去阻遏 也无RNA pol结合
(2)当色氨酸充足时，色氨酰tRNA供给充足，核糖体迅速翻译序列1
合成前导肽，并对序列2形成约束，使序列2、3不能形成茎环结 构，转而序列3、4形成转录终止子结构衰减子，使下游正在转 录结构基因的RNA聚合酶脱落，终止转录
转录衰减机制:
新生肽链 核糖体
5’ 1 2
衰减子结构 (attenuator)
3
4
mRNA
UUUU 3’
DNA
trp 密码子当色氨酸来自度高时核糖体5’
1
2
3 4
当色氨酸浓度低时
高Trp时： Trp-tRNATrp 存在
核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2
片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖ρ因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物 转录、翻译偶联,产生前导肽
前导序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密码前一 个长162nt的mRNA片段。
第10和第11位上有相 邻的两个色氨酸密码子
转录与翻译的偶联是衰减调控的基础 色氨酰tRNA浓度的变化是衰减调控的信号
(1)当色氨酸缺乏时，色氨酰tRNA供给不足，合成前导肽的核糖体
停滞于序列1的色氨酸密码子位点，序列2、3形成茎环结构，使
结合乳糖、G存在与否及与操纵子正、负控因素、 基因开放与关闭情况如下：
葡萄糖（G） 乳糖 基因开放 基因关闭 机理简述（学生填充）
①
×
× √ √
√
× × √
√
√ √ √
CAP正控、乳糖去阻遏、基因开放、转录进行 不能诱导去阻遏，CAP即使结合，基因未开放 细菌优先用G，无CAP结合，无诱导去阻遏 CAMP-CAP复合物无，CAP位点空，去阻遏 也无RNA pol结合
《现代分子生物学》第五章 3 真核生物的转录后加工
各种参与剪接的成分形成一个剪接体系， 称为剪接体（spliceosome）。该体系由 几种snRNP和大量的其他的蛋白质分子 组成，这些蛋白质分子称为剪接因子， 估计有40多种。 剪接点和分支点序列由剪接体识别， snRNA和蛋白质都参与了识别，特别是 snRNA之间以及与mRNA间的碱基配对 起重要作用。
RNA印迹法（RNA blotting）可用于分析核 RNA剪接过程中的中间体，从而确定内含 子的去除顺序。 实验中可以发现含有不同内含子的中间产 物，因此内含子的去除似乎没有特定的顺 序，但也发现有一定的规律，说明剪接有 特定的途径。
剪接反应并不是按内含子在RNA前体上 的顺序进行的。 RNA的构象影响剪接点的选择。在去除 特定的内含子后，RNA的构象发生一定 的变化，再选择新的剪接点。
剪接体Splicesome： snRNA：U1， U2， U4， U5， U6 snRNP：U＋蛋白 质
剪接体按一定的顺序组装，已分离到一些 组装的中间体。只有组装完整的剪接体才 有功能。在剪接反应中，剪接体还会释放 和添加某些成分。 转酯反应只是磷酸酯键的直接转移，没有 水解反应的出现，因此不需要外部的能量， 也不需要供能物质如ATP或GTP的参与。 剪接体中起催化转酯反应的成分尚未弄清 楚，也不知道是蛋白质还是RNA在起作用。
一、核基因mRNA的剪接 一、核基因mRNA的剪接
mRNA的基因在低等真核生物中只有少数含 有内含子，为不连续基因。随着进化程度的 增高，不连续基因的数目不断增加。 细胞核中有一类RNA，十分不稳定，平均长 度比mRNA要长，序列的复杂程度非常高， 称为核内不均一RNA（ heterogeneous nuclear RNA，hnRNA ）。
RNA processing 1
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
现代分子生物学第五章基因表达调控
江汉大学文理学院
16
AraC蛋白同时显正、负调节因子的功能。阿拉伯 糖操纵子的操纵基因受AraC蛋白调节。AraC蛋白具有 两种不同的功能构象，即正、负调节因子的双重功能 构象。一般认为Pr是起阻遏作用的构象形式，可与操 纵区位点相结合，Pi是起诱导作用的构象形式，通过 与PBAD启动子结合进行调节。Pr和Pi两种构象处于动态 平衡之中。当缺乏诱导物阿拉伯糖时，AraC处于Pr状 态，不结合araI而是结合操纵基因位点，阻碍araBAD 的表达。当阿拉伯糖存在时，由araC编码的激活蛋白 AraC与其结合，改变了AraC的构象显出Pi，该复合物 结合于araL区后可激活PBAD转录。
江汉大学文理学院
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2．乳糖操纵子的调控机制 当培养基中没有乳糖时，调节基因编码的阻遏蛋白结合到操纵基因上，阻 止了结构基目的表达。将大肠杆菌转到乳糖培养基中时，由于诱导物分子结 合在阻遏蛋白的特异部位，引起阻遏蛋白构象改变，而不能结合到操纵基因 上，操纵子被诱导表达。在这个系统中的诱导物分子不是乳糖本身，而是乳 糖的同分异构体——异乳糖。乳糖进入大肠杆菌细胞后被转化成了异乳搪。
江汉大学文理学院
3
（一）细菌细胞对营养的适应
为了生存，细菌必须能够适应广泛变化的环境条件。这些环境条件包括 营养、水分、溶液浓度、温度、pH等。而这些条件又必须通过细胞内的各种 生化反应途径，为细胞的生长繁殖提供能量和构建细胞组分所需的小分子化 合物。一般细菌如火肠杆菌所需的碳源首先是葡萄糖，利用葡萄糖发酵获得 能量，维持生存。在缺乏葡萄糖时细菌也可以利用其他糖类（如乳糖）作为 碳源维持生存。 （二）结构基因和调节基因 结构基因(structural gene)是编码蛋白质或功能RNA的基因。细菌的结构 基因一般成簇排列，多个结构基因受单一启动子共同控制，使整套基因或都 表达或者都不表达。结构基因编码大量功能各异的蛋白质，其中有组成细胞 和组织器官基本成分的结构蛋白、有催化活性的酶和各种调节蛋白等。调节 基因(regu1ator，gene)是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的 特异DNA序列。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合控制转录 是调控的关键。调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式(启动或 增强基因表达活性)调节靶基因，也能以负调控的方式(关闭或降低基因表达 活性)调节靶基因。它们通常位于受调节基因的上游，但有时也有例外。
现代分子生物学课件
DNA聚合酶
▪ DNA分子切割
限制性内切酶
▪ DNA片段与载体连接
DNA连接酶
▪ DNA凝胶电泳
▪ 细胞转化及重组子的筛选与鉴定等
2020/12/8
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分子生物学的研究内容
DNA重组技术
三大基本工具: ➢ “分子手术刀” 限制性核酸内切酶 ➢ “分子缝合针” DNA连接酶 ➢ “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体
（4）基因组、功基因组与生物信息学研究
基因组（genome): 生物有机体的单倍体细胞中的所有DNA，包括
核中的染色体DNA和线粒体、叶绿体等亚细胞器中 的DNA。
P. 456
2020/12/8
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分子生物学的研究内容 基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划: 测定基因组序列。
- 人类基因组计划 目的是揭开人类所有的遗传结构, 包括所有的基因(尤其是与疾病相关的基因)和基因外 序列的结构。1990年-2001年，美、英、法、德、 日、中 6 国的合作已完成人类基因的全部序列测定工 作。见表2-1, P. 19. - 小家鼠、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、啤酒酵母，以 及多种真菌、细菌的基因组研究相继展开，其中拟南 芥基因组的全序列测定已完成。
结构分子生物学
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结 构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
主要包括三个研究方向： ✓ 结构的测定 采用X射线衍射、二维或多维核磁共振等方法 ✓ 结构运动变化规律的探索 ✓ 结构与功能相互关系的建立
2020/12/8
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分子生物学的研究内容 基因组、功能基因组与生物信息学研究
(3.2 108bp)。 ➢2001年, 完成人类基因组全序列测定(3.5 109bp)。
现代分子生物学课件-第五章
图5-3 重组DNA操作过程示意图
目的基因的表达
5. 2 DNA基本操作技术
5. 2. 1 核酸凝胶电泳技术
自从琼脂糖（ agarose ）和聚丙烯酰胺 （ polyacrylamide ）凝胶被引入核酸研究以 来，按分子量大小分离 DNA 的凝胶电泳技 术，已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验 手段。
由于在 PCR 反应中所选用的一对 引物，是按照与扩增区段两端序列 彼此互补的原则设计的，因此每一 条新生链的合成都是从引物的退火 结合位点开始并朝相反方向延伸的。
整个 PCR 反应的全过程，即 DNA 解链（变性）、引物与模板 DNA 相 结合（退火）、 DNA 合成（链的延 伸）三步，可以被不断重复。经多 次循环之后，反应混合物中所含有 的双链 DNA 分子数，即两条引物结 合位点之间的 DNA 区段的拷贝数， 理论上的最高值应是2n。
转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收 外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感 受态的操作叫致敏过程。 重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学 方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以 便外源DNA进入细菌内。 这项技术始于Mandel和Higa 1970年的观察，他们 发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后， 容易被 λ 噬菌体 DNA感染，随后 Cohn 于 1972 年进一 步证明质粒DNA用同样的方法也可进入细菌。
(5)引物3‘末端碱基:原则上要求引物3’末端与模板 DNA一定要 配对。 (6)引物5'末端碱基:PCR反应物5'末端碱基并没有严格的限制， 只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5'末端碱基可以不与 模板DNA匹配而呈游离状态。
《现代分子生物学》第五章 3 真核生物的转录后加工
真核细胞中rRNA的加工途径 真核细胞中rRNA的加工途径
(1) 切除5′端的前导序列； (2) 从41S的中间产物中先切下18S的片段。 (3) 部分退火，形成发夹结构； (4) 最后修正。
真核细胞中rRNA的加工 真核细胞中rRNA的加工
目前还不清楚45S前体在剪切位点断裂后是否 就产生成熟的末端，还是要经进一步的加工。 整个加工过程需要蛋白质的参与，可能形成核 蛋白体的形式。 rRNA的加工过程还需要snoRNA （small nucleolar RNAs ）的参与。 真核生物的5S rRNA是和tRNA转录在一起的， 经加工处理后成为成熟的5S rRNA。
真核细胞核mRNA的加帽反应 真核细胞核 的加帽反应
不同真核生物的mRNA可有不同的帽子结构， 同一种真核生物的mRNA也常有不同的帽子 结构。 帽子结构的作用： 1.为核糖体识别RNA提供信号 2.增加mRNA的稳定性 3.为mRNA向胞质的运输提供信号 4 与某些RNA病毒的正链RNA的合成有关。
各种参与剪接的成分形成一个剪接体系， 称为剪接体（spliceosome）。该体系由 几种snRNP和大量的其他的蛋白质分子 组成，这些蛋白质分子称为剪接因子， 估计有40多种。 剪接点和分支点序列由剪接体识别， snRNA和蛋白质都参与了识别，特别是 snRNA之间以及与mRNA间的碱基配对 起重要作用。
1. rRNA的转录后加工 rRNA的转录后加工
真核生物有4种rRNA，即5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和5S rRNA。其中前三者 的基因组成一个转录单位，产生47S的前 体，并很快转变成45S前体。 45S前体上有许多甲基化的位点，在转录 过程中或转录后被甲基化。甲基基团主要 是加在核糖上。甲基化是45S前体最终成 为成熟rRNA区域的标志。
分子生物学课件第五章 同源重组、位点特异性重组
The Holliday Model
* This model of recombination was first proposed by Robin Holliday in 1964 and re-established by David Dressler and Huntington Potter in 1976 who demonstrated that the proposed
Fig. 22.5 f-h
8. The nicks are sealed by DNA ligase, yielding a Holliday junction.
9. Branch migration occours, sponsored by RuvA and RuvB.
10. RuvC resolves the structure.
6. The invading strand basepaired with a homologous region, releasing SSB and RecA.
7. RecBCD nicks the loopingout strand. RecA and SSB helps strand exchange.
Roles
Generating new gene/allele combinations (crossing over during meiosis)
Generating new genes (e.g., IgG rearrangement)
Integration of a specific DNA element DNA repair
* The two molecules must share a region of homologous (i.e. nearly identical) DNA sequence - a minimum of 30-151 bp is required.
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英文影印版/中文版
发酵
大规模利
上
用酵母
千
十
1928，Flemming
年
九
青霉素
世
纪
Biotechnology
Karl Ereky (1917, Hungary) 甜菜饲料 --〉养猪 生物制品，初级发酵
1970s，DNA重组技术
重组DNA技术是现代生物技术的核心
分子操作 DNA技术 基因操作 遗传工程 基因工程
限制酶重要特点：
用于DNA分子的鉴定、识别、分析等。 用于异源DNA黏接重组 即：识别特定序列（多为回文序列）； 产生粘性末端（5’-P，3’-OH）； 产生特定的限制酶片断
6bp回文序列
限制性片段
平
平
限制性内切核酸酶的命名：
按酶的来源的属、种名而定。取属名的第一个字母与种名的头两个字母组 成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先 后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先 后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
5.1 重组DNA技术回顾
理论基础： 1940s：DNA是遗传物质 1950s：DNA双螺旋结构 1960s：破译遗传密码、中心法则、操作子学说 1970s：DNA分子的切割与连接： 体外DNA重组
DNA分子操作的重要“工具”相继被发现直接推动了本领的发展： 1970，限制性核酸內切酶(Restriction Endonuclease, RE) 1967，DNA连接酶(Ligase) 1973，载体(Vector) 1970，宿主细胞(Host cell)
1970， Smith 和 Wilcox 在流感嗜血杆菌中分离纯化了 限制性内切酶Hind II； 1972 ，Boyer实验室发现核酸内切酶 Eco RI
DNA 酶学回顾
(1955), Arthur Kornberg and colleagues isolated DNA polymerase.
(1966), B. Weiss and C.C. Richardson isolated DNA ligase.
Ref. to P156, T5-1
5.1.1限制性核酸内切酶
核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）：从核酸的末端一个接一个水解核苷酸； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸的链中间水解3’，5’磷酸二酯键， 将核酸分子切断。
限制性内切酶来自细菌内具有保护自身遗传物质稳定的限制修饰体系，该体 系一方面甲基化修饰自体的DNA，为自己所识别而不被内部限制酶水解。外来入 侵DNA没有所识别的标记，则被核酸内切酶水解。此体系具有修饰自己限制外来 的作用，限制性内切核酸酶由此得名，1963年在细菌中发现。
几个重要技术的原理和操作： DNA操作技术(包括基因克隆及相应的筛选鉴定和分析)、 RNA操作技术(分离纯化,特别是mRNA纯化/反转录, iRNA)、 PCR技术及PC、 定点突变技术\、基因表达分析技术、 DNA测序及自动化测序仪的原理、DNA足迹试验、 蛋白质-蛋白质互作、蛋白质-DNA互作的研究技术、 噬菌体展示技术
同义词
核心实验操作:
DNA分子的切割与连接、 分子杂交、凝胶电泳、 细胞转化、序列分析及人工合成、 PCR、定点突变
……
重组DNA技术:
体外构建重组DNA分子（重组子）：外源DNA + 载体 转化宿主细胞： 向宿主引入重组子 被转化宿主细胞(转化子)稳定遗传和表达新特性
意义和应用：DNA分子克隆；遗传修饰；特定产品表达
的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所 识别的序列。是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶（Type III） 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称
序列，切割位与认知序列ห้องสมุดไป่ตู้距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性核酸内切酶识别的DNA序列一般为4 ~ 8bp。 对于随机序列，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶
(1968). H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley isolated and characterized the first sequence
specific restriction nuclease.
1950S’ Phage growth restriction. 1960S’ Methylase and nuclease. Stewart Linn and Werner Arber isolated examples of the two types of RE. 1968, Site-specific nuclease. H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley,
重要工具酶及其应用： 限制性核酸内切酶、连接酶、… 限制性内切核酸酶被发现的意义？ 限制-修饰系统？
参考书
1、生物化学与分子生物学实验技术 （面向21世纪教材）杨安钢等编 高教出版社 2、现代生物技术
瞿礼嘉等编 高教出版社 3、精编分子生物学实验指南 （第四版中译版） 科学出版社 4、基因克隆实验指南（第三版）
限制酶类型 根据结构,辅因子的需求，切位与作用方式，分为三种类型。
第一型限制酶（Type I） 多亚基，同时具有修饰及识别切割的作用；通常其切割位距离识别可达数千
个碱基之远。 需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶（Type II） 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。无需ATP和SAM。所识别
5 分子生物学研究方法(上)
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组学及其研究技术
名词： 生物技术、基因工程、生物工程、蛋白质组学、生物芯片、RNA 干扰、 基因敲除技术、大规模克隆技术、遗传多态性：SNP、RFL P、…
发酵
大规模利
上
用酵母
千
十
1928，Flemming
年
九
青霉素
世
纪
Biotechnology
Karl Ereky (1917, Hungary) 甜菜饲料 --〉养猪 生物制品，初级发酵
1970s，DNA重组技术
重组DNA技术是现代生物技术的核心
分子操作 DNA技术 基因操作 遗传工程 基因工程
限制酶重要特点：
用于DNA分子的鉴定、识别、分析等。 用于异源DNA黏接重组 即：识别特定序列（多为回文序列）； 产生粘性末端（5’-P，3’-OH）； 产生特定的限制酶片断
6bp回文序列
限制性片段
平
平
限制性内切核酸酶的命名：
按酶的来源的属、种名而定。取属名的第一个字母与种名的头两个字母组 成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先 后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先 后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
5.1 重组DNA技术回顾
理论基础： 1940s：DNA是遗传物质 1950s：DNA双螺旋结构 1960s：破译遗传密码、中心法则、操作子学说 1970s：DNA分子的切割与连接： 体外DNA重组
DNA分子操作的重要“工具”相继被发现直接推动了本领的发展： 1970，限制性核酸內切酶(Restriction Endonuclease, RE) 1967，DNA连接酶(Ligase) 1973，载体(Vector) 1970，宿主细胞(Host cell)
1970， Smith 和 Wilcox 在流感嗜血杆菌中分离纯化了 限制性内切酶Hind II； 1972 ，Boyer实验室发现核酸内切酶 Eco RI
DNA 酶学回顾
(1955), Arthur Kornberg and colleagues isolated DNA polymerase.
(1966), B. Weiss and C.C. Richardson isolated DNA ligase.
Ref. to P156, T5-1
5.1.1限制性核酸内切酶
核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）：从核酸的末端一个接一个水解核苷酸； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸的链中间水解3’，5’磷酸二酯键， 将核酸分子切断。
限制性内切酶来自细菌内具有保护自身遗传物质稳定的限制修饰体系，该体 系一方面甲基化修饰自体的DNA，为自己所识别而不被内部限制酶水解。外来入 侵DNA没有所识别的标记，则被核酸内切酶水解。此体系具有修饰自己限制外来 的作用，限制性内切核酸酶由此得名，1963年在细菌中发现。
几个重要技术的原理和操作： DNA操作技术(包括基因克隆及相应的筛选鉴定和分析)、 RNA操作技术(分离纯化,特别是mRNA纯化/反转录, iRNA)、 PCR技术及PC、 定点突变技术\、基因表达分析技术、 DNA测序及自动化测序仪的原理、DNA足迹试验、 蛋白质-蛋白质互作、蛋白质-DNA互作的研究技术、 噬菌体展示技术
同义词
核心实验操作:
DNA分子的切割与连接、 分子杂交、凝胶电泳、 细胞转化、序列分析及人工合成、 PCR、定点突变
……
重组DNA技术:
体外构建重组DNA分子（重组子）：外源DNA + 载体 转化宿主细胞： 向宿主引入重组子 被转化宿主细胞(转化子)稳定遗传和表达新特性
意义和应用：DNA分子克隆；遗传修饰；特定产品表达
的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所 识别的序列。是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶（Type III） 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称
序列，切割位与认知序列ห้องสมุดไป่ตู้距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性核酸内切酶识别的DNA序列一般为4 ~ 8bp。 对于随机序列，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶
(1968). H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley isolated and characterized the first sequence
specific restriction nuclease.
1950S’ Phage growth restriction. 1960S’ Methylase and nuclease. Stewart Linn and Werner Arber isolated examples of the two types of RE. 1968, Site-specific nuclease. H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley,
重要工具酶及其应用： 限制性核酸内切酶、连接酶、… 限制性内切核酸酶被发现的意义？ 限制-修饰系统？
参考书
1、生物化学与分子生物学实验技术 （面向21世纪教材）杨安钢等编 高教出版社 2、现代生物技术
瞿礼嘉等编 高教出版社 3、精编分子生物学实验指南 （第四版中译版） 科学出版社 4、基因克隆实验指南（第三版）
限制酶类型 根据结构,辅因子的需求，切位与作用方式，分为三种类型。
第一型限制酶（Type I） 多亚基，同时具有修饰及识别切割的作用；通常其切割位距离识别可达数千
个碱基之远。 需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶（Type II） 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。无需ATP和SAM。所识别
5 分子生物学研究方法(上)
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组学及其研究技术
名词： 生物技术、基因工程、生物工程、蛋白质组学、生物芯片、RNA 干扰、 基因敲除技术、大规模克隆技术、遗传多态性：SNP、RFL P、…