浓香型白酒产糖化酶菌株筛选及产酶条件研究_冯瑞章

Research Report
1g、KCl 0.5g、MgSO·4 7H2O 0.5g、FeSO·4 7H2O 0.01g、蒸馏水 1000mL，自然pH值。 1.3 方法 1.3.1 高产糖化酶菌株的筛选
将保存菌株活化后，制备孢子悬液，调整浓度至107CFU/mL， 点接 10μL 于透明圈培养基上，37℃培养6d，检测菌落直径 （d）及其周围透明圈直径（D）的大小，计算 D/d 值，筛选 D/d 值最大的1株菌进行酶学特征研究。 1.3.2 菌株糖化酶活力测定
透明圈直径（D）、菌落生长直径（d）及其比值是表征
菌株糖化酶能力高低的一个指标。将14株糖化酶菌株分 别接种于透明圈固体培养基上培养6d后（见表1），发现9株 菌可以产生明显的透明圈（D≥1.60cm），其中J8M-53 菌株 产生的透明圈最大（2.70cm），D/d值可达到1.74，说明该菌 株产糖化酶能力明显高于其他菌株。因此，选择J8M-53菌 株作为出发菌株，进一步研究其产酶条件。
Abstract: 14 mold strains were isolated from the air in Daqu workshop of Luzhou-flavor liquor in Yibin, and a highly glucoamylase-producing strain was screened by transparent circle method. After 96h of liquid culture, the glucoamylase activity reached 887U/ml. Then the effects of different culture condition on the glucoamylase activity of J8M-53 were studied by single factor experiment. The results showed that the optimum initial pH value, temperature and carbon source for glucoamylase were 5.0, 30℃ and soluble starch, respectively. However, when the initial pH at 4, the culture at 40℃, activity of the enzyme remained a higher standard, and the strain was also able to use the other carbon sources. The strain was aerobic bacteria or facultative anaerobes, and had a great requirement for O2. Furthermore, the glucoamylase activity of J8M-53 depends on the concentrain ethanol, and the maximum activity of the enzyme was exhibited at 6%vol. But the high concentrain of ethanol may inhibit the enzymatic activity. The enzymatic activity got 74% of the maximum, when alcohol concentration was 12%vol. Key words: Luzhou-flavor liquor; glucoamylase-producing strain; screening; enzyme production conditions
金项目（2009B03） 作者简介：冯瑞章（1978-），副教授，博士，主要从事微生物资源开发与利用等研究工作。 *通讯作者：王 涛（1973-），副教授，硕士，主要从事微生物资源开发与利用等研究工作。
2013 Vol.32 No．10
·82· Serial No．259
China Brewing
该菌株属于好氧菌或者兼性厌氧菌，对氧的需求量较大。另外，该菌株对酒精有一定的依赖性，并具有较强的耐酒精能力，当培养液
中酒精浓度为6%vol时，菌株的糖化酶活性最高，酒精浓度为12%vol时的糖化酶活性是最大值的74%。
关 键 词：浓香型白酒；糖化酶菌株；筛选；产酶条件
中图分类号：TQ925
文献标识码：A
于150mL三角瓶中装入50mL分别以可溶性淀粉、葡 萄糖、蔗糖、乳糖、小麦粉和玉米粉为碳源的液体发酵培 养基，如1.3.2所述方法接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖 化酶活力。 1.3.4 初始pH值的影响
于150mL三角瓶中装入50mL液体发酵培养基，调节 初始 pH值为分别为4、5、6、7、8、9、10，接种糖化酶菌株， 培养4d后测定糖化酶活力。 1.3.5 发酵温度的影响
文章编号：0254-5071（2013）10-0081-04
Screening of a highly glucoamylase-producing strain from Luzhou-flavor liquor and the enzyme production conditions
FENG Ruizhang1,2, PANG Jianyi2, WANG Tao1,2*, YOU Ling1,2
图1 菌株产糖化酶动态 Fig. 1 The glucoamylase activity trend of J8M-53
2.3 培养条件对菌株发酵产糖化酶活力的影响
研究报告
中国酿造
2013 年 第 32 卷 第 10 期
总第 259 期
·83·
注：A、pH值；B、温度；C、碳源类型；D、装液量；E、酒精浓度。 图2 培养条件对菌株发酵产糖化酶能力的影响
于150mL三角瓶中装入 50mL液体发酵培养基，接种 1mL浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，分别在15℃、20℃、 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下摇床培养4d，测定 糖化酶活力。 1.3.6 溶解氧的影响
同 一 规 格 和 型 号 的 150mL 三 角 瓶 中 盛 入 不 同 体 积 （25mL、50mL、75mL、100mL、125mL）的液体发酵培养基， 接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。 1.3.7 菌株的耐受酒精性
1.09
1.51
1.09
1.52
1.12
1.52
1.12
1.55
1.10
1.52
1.15
1.55
1.74
2.2 发酵时间对菌株发酵产糖化酶活力的影响 将J8M-53菌株接种于发酵培养基中培养，考察培养时
间对该菌株产糖化酶能力影响，结果见图 1。随发酵时间 的延长，糖化酶活性逐渐增加，培养96h后，酶活达到最高 值，随着发酵时间的继续增加，糖化酶活性呈逐渐下降趋 势。值得注意的是，在发酵初始阶段（0~48h），酶活力增加 相对缓慢，48h以后，其活性迅速增加，72h和96h时的酶活 分别为24h时酶活性的5.8和7.2倍，为48h时酶活性的2.8 和3.6倍；在96h~144h时，酶活性降低速度相对缓慢，说明 糖化酶发挥作用的时间段较长。
研究报告
中国酿造
2013 年 第 32 卷 第 10 期
ຫໍສະໝຸດ Baidu
总第 259 期
·81·
浓香型白酒产糖化酶菌株筛选及产酶条件研究
冯瑞章1，2，庞建义2，王 涛1，2*，游 玲1，2
（1.宜宾学院 发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000； 2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644000）
（1）透明圈培养基[11]：可溶性淀粉10g、琼脂20g、蒸馏 水1000L，自然pH值。
（2）发酵摇瓶培养基[11]：碳源10g、NaNO3 2g、K2HPO4
收稿日期：2013-07-25 基金项目：四川省教育厅科研项目（13ZA0201）；发酵资源与应用四川省高校重点实验室开放基金项目（2010KFZ004）；宜宾学院博士启动基
本研究对分离自宜宾多粮浓香型白酒曲房空气的产
糖化酶菌株进行筛选，对产酶能力较强的1株菌进行产酶 条件研究，以期获得高产糖化酶的菌株及其适宜的产酶条 件，为扩大微生物菌种资源的开发和微生物糖化酶的生产 应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料
分离自宜宾浓香型白酒曲房空气中的14株霉菌菌株， 于宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室保存。 1.2 培养基
于150mL三角瓶中装入 50mL液体发酵培养基，调节 酒精度分别为2%vol、5%vol、8%vol、12%vol、16%vol，接种 糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。 1.4 数据分析
用Excel 2003和SPSS13.0软件对实验数据进行方差分 析和显著性测验。 2 结果分析 2.1 高产糖化酶菌株筛选
摘 要：利用透明圈法从浓香型白酒曲房空气中筛选得到1株产糖化酶能力较强的菌株（J8M-53），液体培养96h后，糖化酶活性可以
达到887U/mL。研究发酵条件对该菌株产糖化酶能力影响，结果表明：虽然该菌株产糖化酶的最适初始pH值、培养温度和最佳碳源分
别为5℃、30℃和可溶性淀粉，但在pH值为4，培养温度为40℃时酶活依然保持在较高的水平，且菌株对其他各碳源都有一定的利用。
J8M-39
1.60
G8M-24
1.61
G8M-18
1.65
Z8M-41
1.65
W8M-30
1.70
W8M-33
1.70
J8M-57
1.70
Z8M-58
1.75
J8M-53
2.70
1.50
1.01
1.50
1.01
1.50
1.01
1.50
1.02
1.50
1.03
1.50
1.07
1.50
1.07
1.51
于150mL三角瓶中装入 50mL液体发酵培养基，接种 1mL浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，30℃、130r/min培养 5d，发酵结束以后，取发酵液于离心管中，在 6000r/min 离心10min，收集上清液即为粗酶液。按照张娥等 及 [12] MICHELINM等[13]的方法，将糖化酶分离纯化。经分离纯 化的糖化酶按照GB 8276—2006《糖化酶制剂》中要求测 定[14]。酶活力的定义：在分析条件下，1mL粗酶液 1h水解底物 释放出1mg葡萄糖的酶量为1个酶活单位，用 U/mL表示[15]。 1.3.3 菌株糖化酶发酵特征研究
表1 产糖化酶菌株筛选 Table 1 Screening of highly glucoamylase-producing strain
菌株编号
水解圈直径（D）/cm 菌落直径（d）/ cm D/d
W8M-17
1.52
Z8M-16
1.52
Z8M-56
1.52
Z8M-12
1.53
W8M-54
1.55
浓香型白酒的生产依赖于生产环境内众多微生物的协 同参与。微生物作用下高分子化合物的降解、代谢产物的相 互作用是决定白酒产量和品质的关键因素[1-3]。糖化酶又称 为淀粉酶（amylase），是葡糖淀粉酶（glucoamylase EC.3.2. 1.3）的简称，主要由酿造环境中的霉菌代谢产生[4-6]。因该 酶能够将淀粉水解为葡萄糖而在浓香型白酒酿造中发挥 重要作用，行业内普遍认为淀粉质原料糖化发酵不完全是 浓香型白酒产酒率偏低的主要原因[7-9]。随着白酒工业的发 展，利用糖化酶作为糖化剂提高白酒出酒率，已被众多白 酒企业普遍采用[10]。因此，筛选优良产糖化酶菌株，对浓香 型白酒生产降低能源消耗和生产成本具有重要意义。
(1.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province,Yibin 644000, China; 2.College of Life Science & Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China)