酵母双杂交(自激活) (2)
酵母双杂交
应用酵母双杂交系统对Prp蛋白与 shadoo蛋白互作的研究
1诱饵质粒的构建 2猎物质粒的构建 3诱饵质粒与猎物质粒的可行性检验及互作 4结果分析
第二十八页，共60页。
PRP蛋白：朊蛋白 PRNP：朊蛋白基因 Shadoo蛋白：与朊蛋白在N端结构上及其相似
的新蛋白 SPNR：Shadoo蛋白的结构基因
第二十页，共60页。
转印
相互作用
第二十一页，共60页。
(2) Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。这项技术的关键是报道基因 URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,
它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸 (5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。
第三十七页，共60页。
C) 感受态细菌的转化
1)将DH5a感受态细胞从-70℃冰箱中取出,立即置于冰水 中,10min融化; 2)将10μL连接产物加入DH5a感受态细胞溶液中(超净工作 台进行),轻轻吹打混匀,冰浴30min。42℃水浴热激2min,此
⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。
1)由于某些蛋白本身具有激活转录功能。在酵母中表
达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录。 2)某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与 其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
重组质粒的小量提取按vitagene生物公司开发的柱离心式琼脂糖凝胶dna质粒小量提取试剂盒进行操作将所提质粒dna在10琼脂糖凝胶上进行电泳紫外灯下观察质粒提取情况并拍照并贮存于20重组质粒的鉴定将经过电泳筛选出的可疑阳性克隆质粒进行bamhi和sall双酶切反应37度酶切2h10ddh2o88ltotal20l序列测定经双酶切分析证明连接成功后将保留菌种送上海生工生物技术有限公司进行序列测定
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交的原理和应用
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
酵母双杂
2014.07.20一、酵母双杂交1.传统的酵母双杂酵母双杂交是基于真核生物中的转录调控所建立的。
一般情况下，酵母的转录因子氛围两个结构域：一个是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD），负责结合识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；另一个是位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain, AD)，负责同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
如果当这两个结构域充分的接近时，会启动酵母中相关的基因的表达。
酵母双杂交技术主要利用BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因（如Lacz基因），通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。
酵母双杂交系统包括：1.与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称为诱饵蛋白。
2.与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的成为靶蛋白。
3.带有一个或者多个的报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有:HIS3、URA3、LACZ和绿色应该蛋白等。
2.DUALmembrane系统——一种膜蛋白质互作的研究方法2.1主要针对于：膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白的互作研究2.2应用：两个已知蛋白（其中一个是膜蛋白）间互作关系的验证膜互作蛋白的文库筛选2.3DUAL的作用原理：该系统由分离的泛素介导的蛋白互作信号的识别。
泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白，它经常作为降解信号连接在蛋白质的N端。
泛素能被其特异性的蛋白酶(UBPs)识别并从所连接的蛋白上切割下来，切割位总是位于泛素蛋白的C端。
在酵母细胞中，泛素可以分成两部分分别表达，即其N端部分(NubI, 第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub, 第35~76位氨基酸)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白(Stagljar et al., 1998)。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术。
下面是酵母双杂交AD自激活验证的步骤：
1. 构建酵母双杂交AD靶蛋白的表达载体：将目标蛋白的编码序列克隆到酵母双杂交AD表达载体中，将其与AD激活域相连，以使目标蛋白能够激活报告基因的表达。
2. 转化AD靶蛋白表达载体到酵母菌株中：通过酵母转化方法将AD靶蛋白表达载体导入酵母菌中，使其能够表达目标蛋白并激活报告基因。
3. 培养转化后的酵母菌株：将转化后的酵母菌株分别培养在选择性培养基上，其中包含AD靶蛋白表达载体所对应的选择性标记物，以筛选出成功转化的酵母菌株。
4. 鉴定AD自激活：通过观察报告基因的表达情况，若转化后的酵母菌株在选择性培养基上形成克隆，表明AD靶蛋白具有自激活能力。
此时需要通过相应的对照实验来确认AD靶蛋白的自激活性质。
需要注意的是，酵母双杂交中AD自激活验证的结果需要慎重解读，因为自激活可能会产生误报。
因此，在进行酵母双杂交实验时，通常需要配对对照实验来排除自激活的影响，以确保结果的准确性。
酵母双杂交
酵母双杂交折叠编辑本段基本思想酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain，DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activati酵母双杂交模型on domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合. 而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录.Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用，将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171 菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物(prey)，能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用.折叠编辑本段基本原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
酵母双杂交
酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。
酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点…酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。
酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点的双杂交系统（如Sos蛋白招募系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统和断裂-泛素为基础的双杂交系统）以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统（如以polⅢ为基础的杂交系统和RTA系统）等在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性，扩大了被研究的蛋白质的范围，提高了系统的灵敏度。
酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。
一、酵母双杂交系统原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（DNA binding d omain，简称为DB）和转录激活结构域（activation d omain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交的原理引言：酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将详细介绍酵母双杂交的原理及其在科研领域中的应用。
一、酵母双杂交的基本原理酵母双杂交技术是基于酵母细胞的遗传特性和蛋白质相互作用的原理而发展起来的。
其基本原理可简单概括为以下三个步骤：第一步：构建酵母双杂交载体将目标蛋白质分别与DNA的两个片段（称为“鱼饵”和“猎物”）融合，构建酵母双杂交载体。
鱼饵片段通常与DNA结合蛋白质相连，而猎物片段通常与转录激活蛋白质相连。
第二步：转化酵母细胞将构建好的酵母双杂交载体转化到酵母细胞中。
这里使用的是酵母的双杂交株，其特点是缺失了酵母中的两个转录因子基因。
第三步：筛选蛋白质相互作用在含有适当选择性培养基的培养条件下，酵母细胞将仅在存在蛋白质相互作用的情况下存活下来。
通过对酵母细胞进行筛选，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术已经被广泛应用于生物学研究中，尤其是在蛋白质相互作用的研究方面。
以下是酵母双杂交技术在不同领域的应用：1. 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术是研究蛋白质相互作用的重要方法。
通过酵母双杂交技术，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，进一步研究其功能和调控机制。
2. 蛋白质与DNA或RNA相互作用研究酵母双杂交技术也可以用于研究蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
通过将目标蛋白质与DNA或RNA片段进行融合，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的DNA或RNA序列。
3. 药物靶点筛选酵母双杂交技术在药物研发中也起到了重要的作用。
通过将潜在药物分子与蛋白质片段进行融合，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白质，从而寻找药物的靶点。
4. 疾病相关基因研究酵母双杂交技术也被广泛应用于疾病相关基因的研究中。
通过将疾病相关基因与其他基因片段进行融合，可以筛选出与疾病相关基因相互作用的蛋白质，进一步研究其功能和调控机制。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。
这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。
在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。
二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。
它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。
当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。
简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。
从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。
三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。
此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，
并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因
在生物学功能上的联系。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基
因之间功能相关的主要方法。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致
步骤为:
1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成
诱饵质粒。
2、将待筛选蛋白母细胞中。
酵母双杂交
• 是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微 弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的 表达产物敏感地检测得到，它是一种具有 很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞
起始基因转录需要有反式转录 激活因子的参与
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一端 为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端 为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使 得这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得 下游的LacZ基因和His3基因得以表达。LacZ基因的表达水 平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因 的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能 力。通过缺陷培养基及β半乳糖苷酶的活性的测定就能判断 在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
The End
酵母双杂交
100 = %二倍体
16、用灭菌的牙签或者黄枪头将长在 DDO/X/A 的蓝色菌落挑至更加严格的 QDO/X/A 平板上。 17、所有的 QDO/X/A 阳性相互作用必须做进一步的分析，以确定重复数并验证真正的 分析以消除重复克隆 1、 用 Matchmaker Inse； 分析； 4、 为了尽快验证克隆，回收纯化 PCR 产物并用 T7 引物进的转化可以包含一种以上的相 DDO/X 平板mid Isolation Kit 提取长于 QDO/X 上的酵母质粒。 如果诱饵质粒是用 pGBKT7（带卡纳抗性基因）克隆的，可以用带有 10C．除去假阳性，识别真阳性 1、材料 足够的 Y2HGold 细胞 SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal 平板=DDO/X SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA=QDO/X/A 2、共转一下质粒： pGBKT7/Bait + Prey Empty pGBKT7 + Prey 3、取稀释 10 倍，100 倍的混合液 100ul 涂板： DDO/X QDO/X/A 4、30℃培养 3-5 天后的预期结果： a．真阳性 样品 Bait + candidate prey Empty pGBKT7 + candidate prey 平板 DDO/X QDO/X/A DDO/X QDO/X/A 明显的 2mm 菌落 yes yes yes no 颜色 蓝 蓝 白 N/A
诱饵蛋白的自激活检测
1、材料 克隆好的 pGBKT7-bait 足够的 Y2HGold 细胞 SD/-Trp/X-a-Gal 平板 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 平板 2、转化 100ng pGBKT7-bait 至 Y2HGold 细胞。 3、涂板，100ul （稀释 10 倍和 100 倍） SD/-Trp = SDO SD/-Trp/X-a-Gal = SDO/X SD/-Trp/X-a-Gal/AbA = SDO/X/A 4、培养 3-5 天后预期的结果： 样品 诱饵蛋白自激活检测 诱饵蛋白自激活检测 诱饵蛋白自激活检测 阳性对照（之前） SDO SDO/X SDO/X/A DDO/X/A 选择性平板 明显的 2mm 菌落 Yes Yes No Yes 白 白或者很浅淡的蓝 N/A 蓝 颜色
酵母双杂交自激活检验原理
酵母双杂交自激活检验原理
酵母双杂交自激活检验原理是一种利用两个不同基因组的酵母株进行双杂交，使得一个酵母株与另一株酵母株之间的合作关系形成，从而使其中一个杂交和另外一个杂交可以活化它们原本被遗忘的基因。
通过这种方法，可以识别出酵母菌的激活基因并鉴定其功能。
酵母双杂交自激活检验原理是一种利用两个不同基因组的酵母株进行双杂交，从而形成一个酵母株与另一株之间的合作关系。
每个酵母株中都有一个传统上被称为“特异性杂交”(SP)的杂交，以及一个较新的类型的杂交，称为“自激活”(SA)的杂交。
在SA杂交中，其中一个杂交可以激活另外一个杂交中被遗忘的基因，使其可以进行正常的生物学功能。
通过利用这种双杂交系统，被激活的基因的功能可以通过观察杂交的表型变化而被识别出来。
因此，酵母双杂交自激活检验原理是一种非常有效的方法，用于识别出被遗忘的基因以及其功能。
它能够发挥其潜在的功能，使研究者可以更好地理解和操控复杂的生物途径和功能。
另外，酵母双杂交自激活检验原理也有助于模拟了真实细胞环境中的复杂感应反应，并为许多分子生物学的研究提供新的可能性，以期望发掘到更多未知的基因功能。
酵母双杂交自激活检验原理是未来生命科学实验室研究进步的重要工具，将提供基本生命科学以及分子生物学研究的更多新发现，以改善人类的健康和福祉。
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
酵母双杂交自激活
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 2. 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑
鱼精、600μl TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s~1min至混匀。 3. 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。 4. 加入70μl DMSO，温和颠倒混匀。 5. 42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 6. 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n D N A b i n d i n g d o m a i n
β-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析）
1. 取2ml的Z缓冲液/X- gal溶液润透2张滤纸；
2. 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气 泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；
3. 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸， 沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室 system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
酵母双杂交名词解释
酵母双杂交名词解释酵母双杂交名词解释酵母双杂交是基因学领域的研究方法之一，其主要是通过两种不同类型的酵母菌之间的交配达到检测基因交互作用的目的。
在酵母双杂交中，每个基因都被分别连接到酿酒酵母中唯一的两个分子，利用蛋白质交互作用而使得两种酵母菌互相连接并产生可观测的效果。
本文将按类别对酵母双杂交进行详细解释。
1. 酵母：酵母是一类单细胞真菌，研究人员可以利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物进行基因研究。
酵母具有许多极其有用的特性，比如其遗传可重复性很高，因此研究人员可以利用酵母来进行基于DNA的研究。
2. 双杂交：双杂交是指一种检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过在酵母的细胞内部形成蛋白质复合物，而使蛋白质相互作用的结果在酵母细胞内可观测到，从而达到检测蛋白质交互作用的目的。
在酵母双杂交中，两种酵母菌互相连接，产生可观测的效果。
研究人员可以利用该方法来检测不同蛋白质之间的交互作用。
3. 名词解释：酵母双杂交可以被定义为一种鉴定基因交互作用的方法，该方法通过酵母细胞内的蛋白质交互作用导致的效果来检测基因交互作用。
同时，酵母双杂交也可以被定义为酿酒酵母之间的一种孢子杂交法。
4. 操作方法：酵母双杂交技术需要利用DNA重组方法，将目标基因在拼接时连接到酵母二杂交系统（Y2H）中的激活子，而将其连接到另一种被测体系（prey）中，还需要使用质粒在酵母菌当中进行转化；随后，其菌落在关键培养基上生长出菌丝，涂上试纸液，观察菌落是否变色，判断蛋白之间的作用是否发生。
总之，酵母双杂交在基因学领域中发挥着重要的作用，在生物学的方方面面都有着广泛的应用。
它是许多基因测序研究的前提，也是基因组学的核心研究方法之一。
我们相信，随着科技的不断提高，这一技术将发挥更加巨大的作用，进一步推动基因学领域的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
Yeast two-hybrid system:
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
r e p o r t e r g e n e
His, β-gal
YPDA培养基
YPDA 蛋白胨 酵母提取物 琼脂 0.2%ade 葡萄糖 液体 500ml 10g 5g —— 10ml 10g 固体 100ml 2g 1g 2g 2ml 2g
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。 AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。
Yeast two-hybrid system:
His, β-gal
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（ GAL UAS ）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到 BD 载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。
g e n e
D o th e s e p ro te in s b in d ?
Y
X
X
X YBiblioteka o u r t w o h y b r i d p r o t e i n s b i n d !
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
pH 6.5
灭菌 121℃ 15min
正对照：pGAL4
负对照： pBD-GAL4
酵母菌株感受态细胞制备：
1. 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 2. 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震 荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角 瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 3. 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到， 换单克隆重摇。 4. 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃， 230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 6. 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。 7. 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Suppose we have two proteins...
X
Y
and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
上，即成为酵母感受态细胞。
（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 2. 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑 鱼精、600μl TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s~1min至混匀。 3. 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。 4. 加入70μl DMSO，温和颠倒混匀。 5. 42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 6. 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬 细胞。（ 1×TE室温只能放置1~2hr） 7. 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30℃倒置培养约3-5天，直 至出现菌落。
Y
t h u s f o r m i n g a f u n c t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r . . . X
Y
do we get expression of the reporter?
r e p o r t e r g e n e