毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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亲 和 层 析 （Affinity Chromatography，AFC）是 利 用
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
Abstract： Along with fast development of the gene recombinant technology，the application of genetic engineering product is getting widespread，but the cost of the separation and purification approximately have been being high. So it is essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost. This review focused on progress of Pichia pastoris yeast expression system，the technique of separation and purification of the recombinant proteins recently.
Key words： Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification
从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一 直是个难题。 对于基因重组蛋白纯化技术来说，选 择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决 定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的 杂蛋白。 毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白 质的表达载体。 毕赤酵母能使外源真核基因正确翻 译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于 提纯。 纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋 白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、 反相层析等。
在 中 性 条 件 下 ，根 据 多 肽 的 带 电 性 IEC 可 以 用 来分离、纯化具有生物活性的多肽，通常分为阳离 子柱与阴离子柱两大类及一些新型树脂。 如大孔型 树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶和 琼 脂 糖 凝 胶 树 脂 等[9]。 Garde 等[10]采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 法 使 用 DE52 树 脂 纯 化 人 的 重 组 PSP94 蛋 白 ， 纯 度 大 于 98%。 在 多 肽 类 物 质 的 分 离 分 析 研 究 中 ，对 多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的 多肽分离条件有所不同， 特别是洗脱剂的离子强 度、盐浓度等对纯化影响较大。
1 酵母表达体系
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009 年第 3 期
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
高炳淼 长孙东亭 罗素兰 安婷婷
（热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海洋学院材料与化工学院 海南大学生物技术实验中心，海口 570228）
摘 要： 随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述 了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。
收 稿 日 期 ：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人 才 支 持 计 划 （NCET-04-0837），海 南 省 重 点 学 科 建
设 项 目 专 项 与 海 南 省 教 育 厅 高 等 学 校 科 研 项 目 （Hjkj200719 ） 作 者 简 介 ：高 炳 淼 （1982-）， 男 ，安 徽 明 光 人 ，硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 ：海 洋 药 物 通 讯 作 者 ：罗 素 兰 ，Tel ：0898-66289538 ，E-mail ：luosulan2003@163.com
IEC） 是 通 过 带 电 的 溶 质 分 子 与 离 子 交 换 剂 中 可 交
换的离子进行交换，而达到分离目的的方法。 该法 主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷 的微小差异进行分离、且有较高的分离容量。 几乎 所有的生物大分子都是极性的，所以离子交换法已 广泛用于生物大分子的分离纯化。 离子交换色谱分 辨率高、工作容量大、易于操作，已成为蛋白质、多 肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方 法 ，在 合 成 多 肽 分 离 中 约 有 75%的 工 艺 采 用 离 子 交 换 色 谱[8]。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2009 年第 3 期
每升克级以上水平； 表达的外源蛋白可分泌到胞 外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外 源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗 传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加 了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒 害作用；具有糖基化程度低等多种优点。 与酿酒酵 母 （Saccharomyces ceresiviae）表 达 系 统 相 比 ，巴 斯 德 毕赤酵母具有分泌效率高，表达菌株稳定，表达质 粒不易丢失，不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋 白 的 免 疫 原 性 较 低 ，更 利 于 临 床 应 用[4]。
巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧 化酶基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；同 时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后 的 加 工 与 修 饰 ，从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有 生 物 活 性 [3]。 另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉 价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已 成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到
（Key Laboratory for Tropical Biological Resources，Ministry of Education Ocean College College of Materials & Chemical Engineering Center for Experimental Biotechnology，Hainan University，Haikou 570228）
对于离子交换色谱分离纯化重组蛋白，若要获 得好的分离结果，必须选用适合的基质，其基质主 要 有 3 类 ，包 括 多 糖 、硅 胶 和 有 机 聚 合 物[9]。 Shi 等[11] 采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 和 Macro-prep 陶 瓷 羟 基 磷 灰 石分离纯化在毕赤酵母中分泌表达人的过氧化氢 酶 ， 其 纯 度 达 到 95% ， 产 率 60% 。 传 统 的 离 子 交 换 色谱一般采用多糖类凝胶作为基质，但是存在机械 强度差、承受压力小等缺点，且不能进行快速淋洗， 分离时间长，易造成生物分子的变性、失活。 无机硅 胶 [12]填 料 机 械 强 度 大 、 柱 效 高 、 孔 径 和 颗 粒 大 小 易 于 控 制 ， 但 pH 应 用 范 围 窄 （2.0~8.0）， 硅 胶 表 面 残 余的硅羟基对蛋白质产生不可逆吸附等问题，从而 导致蛋白质的质量回收率低，生物活性损失。 硅胶 涂 敷 固 定 相 [13] 在 连 续 使 用 中 涂 层 易 脱 落 、 稳 定 性 差 。 聚 合 物 基 质[14]固 定 相 具 有 良 好 的 生 物 兼 容 性 、 化学稳定性及易于被衍生化的优点，在生物大分子 分离中的地位越来越重要，其亲水性减小了基质与 蛋 白 之 间 发 生 非 特 异 性 相 互 作 用 的 机 会 ， 可 在 pH 为 1~12 内 广 泛 使 用 。 2.2 亲和层析
近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐， 已有 300 多种外源蛋 白在该表达系统 中 获 得 表 达[5]， 主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物 和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以 及可用于研究晶体结构的蛋白质等。 它还可以同时 表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生 物 催 化 剂[6]。 其 中 利 用 毕 赤 酵 母 分 泌 表 达 的 硫 代 羟 腈 裂 合 酶 已 达 到 14.8 g/L 的 高 产 率 ；而 胞 内 表 达 的 羟 腈 裂 合 酶 达 到 了 22 g/L 的 高 产 率[3]。
关键词： 毕赤酵母 重组蛋白质 分离 纯化
Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in Pichia pastoris Expression System
Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting
表 1 依据蛋白特性采用的分离纯化方法
! & !
(IEC) (GFC) (HIC)(RPC)
!(AC)"#$% !(IMAC) ’()*+ (EBA)
2.1 离子交换 离 子 交 换 色 谱 （Ion Exchange Chromatography，
亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。 根据配体与生物大分子之间相互 作用体系不同， 可以把亲和层析分为生物亲和层 析、免疫亲和层析、金属离子螯合层析、拟生物亲和 层析 4 种 类型[17]。 固定化金属螯合 层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC） 是 近 年 来 发 展 起 来 的 一 种 亲 和 方 法 。 1975 年 ，Porath[18]首 次 wenku.baidu.com 出 固 定 化 金 属 螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）， 并 发 展 为 一 种 有 效的生化分离技术，该方法利用固定在基质上的过 渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、 半胱氨酸、 色氨酸等残基的配位作用来实现对金属离子有亲 和 力 的 蛋 白 质 分 离[19]。 其 中 ，组 氨 酸 是 与 金 属 离 子 作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在 IMAC 中 有 效 保 留 ， 故 多 聚 组 氨 酸 已 成 为 最 常 用 的 蛋 白 质 纯 化 标 签[20，21]。 真 核 表 达 体 系 中 的 毕 赤 酵 母 载体就加入了组氨酸标记，这为应用固定化金属螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）提 供 了 方 便 。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
35
偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
Abstract： Along with fast development of the gene recombinant technology，the application of genetic engineering product is getting widespread，but the cost of the separation and purification approximately have been being high. So it is essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost. This review focused on progress of Pichia pastoris yeast expression system，the technique of separation and purification of the recombinant proteins recently.
Key words： Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification
从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一 直是个难题。 对于基因重组蛋白纯化技术来说，选 择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决 定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的 杂蛋白。 毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白 质的表达载体。 毕赤酵母能使外源真核基因正确翻 译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于 提纯。 纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋 白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、 反相层析等。
在 中 性 条 件 下 ，根 据 多 肽 的 带 电 性 IEC 可 以 用 来分离、纯化具有生物活性的多肽，通常分为阳离 子柱与阴离子柱两大类及一些新型树脂。 如大孔型 树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶和 琼 脂 糖 凝 胶 树 脂 等[9]。 Garde 等[10]采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 法 使 用 DE52 树 脂 纯 化 人 的 重 组 PSP94 蛋 白 ， 纯 度 大 于 98%。 在 多 肽 类 物 质 的 分 离 分 析 研 究 中 ，对 多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的 多肽分离条件有所不同， 特别是洗脱剂的离子强 度、盐浓度等对纯化影响较大。
1 酵母表达体系
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009 年第 3 期
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
高炳淼 长孙东亭 罗素兰 安婷婷
（热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海洋学院材料与化工学院 海南大学生物技术实验中心，海口 570228）
摘 要： 随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述 了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。
收 稿 日 期 ：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人 才 支 持 计 划 （NCET-04-0837），海 南 省 重 点 学 科 建
设 项 目 专 项 与 海 南 省 教 育 厅 高 等 学 校 科 研 项 目 （Hjkj200719 ） 作 者 简 介 ：高 炳 淼 （1982-）， 男 ，安 徽 明 光 人 ，硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 ：海 洋 药 物 通 讯 作 者 ：罗 素 兰 ，Tel ：0898-66289538 ，E-mail ：luosulan2003@163.com
IEC） 是 通 过 带 电 的 溶 质 分 子 与 离 子 交 换 剂 中 可 交
换的离子进行交换，而达到分离目的的方法。 该法 主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷 的微小差异进行分离、且有较高的分离容量。 几乎 所有的生物大分子都是极性的，所以离子交换法已 广泛用于生物大分子的分离纯化。 离子交换色谱分 辨率高、工作容量大、易于操作，已成为蛋白质、多 肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方 法 ，在 合 成 多 肽 分 离 中 约 有 75%的 工 艺 采 用 离 子 交 换 色 谱[8]。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2009 年第 3 期
每升克级以上水平； 表达的外源蛋白可分泌到胞 外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外 源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗 传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加 了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒 害作用；具有糖基化程度低等多种优点。 与酿酒酵 母 （Saccharomyces ceresiviae）表 达 系 统 相 比 ，巴 斯 德 毕赤酵母具有分泌效率高，表达菌株稳定，表达质 粒不易丢失，不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋 白 的 免 疫 原 性 较 低 ，更 利 于 临 床 应 用[4]。
巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧 化酶基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；同 时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后 的 加 工 与 修 饰 ，从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有 生 物 活 性 [3]。 另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉 价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已 成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到
（Key Laboratory for Tropical Biological Resources，Ministry of Education Ocean College College of Materials & Chemical Engineering Center for Experimental Biotechnology，Hainan University，Haikou 570228）
对于离子交换色谱分离纯化重组蛋白，若要获 得好的分离结果，必须选用适合的基质，其基质主 要 有 3 类 ，包 括 多 糖 、硅 胶 和 有 机 聚 合 物[9]。 Shi 等[11] 采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 和 Macro-prep 陶 瓷 羟 基 磷 灰 石分离纯化在毕赤酵母中分泌表达人的过氧化氢 酶 ， 其 纯 度 达 到 95% ， 产 率 60% 。 传 统 的 离 子 交 换 色谱一般采用多糖类凝胶作为基质，但是存在机械 强度差、承受压力小等缺点，且不能进行快速淋洗， 分离时间长，易造成生物分子的变性、失活。 无机硅 胶 [12]填 料 机 械 强 度 大 、 柱 效 高 、 孔 径 和 颗 粒 大 小 易 于 控 制 ， 但 pH 应 用 范 围 窄 （2.0~8.0）， 硅 胶 表 面 残 余的硅羟基对蛋白质产生不可逆吸附等问题，从而 导致蛋白质的质量回收率低，生物活性损失。 硅胶 涂 敷 固 定 相 [13] 在 连 续 使 用 中 涂 层 易 脱 落 、 稳 定 性 差 。 聚 合 物 基 质[14]固 定 相 具 有 良 好 的 生 物 兼 容 性 、 化学稳定性及易于被衍生化的优点，在生物大分子 分离中的地位越来越重要，其亲水性减小了基质与 蛋 白 之 间 发 生 非 特 异 性 相 互 作 用 的 机 会 ， 可 在 pH 为 1~12 内 广 泛 使 用 。 2.2 亲和层析
近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐， 已有 300 多种外源蛋 白在该表达系统 中 获 得 表 达[5]， 主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物 和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以 及可用于研究晶体结构的蛋白质等。 它还可以同时 表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生 物 催 化 剂[6]。 其 中 利 用 毕 赤 酵 母 分 泌 表 达 的 硫 代 羟 腈 裂 合 酶 已 达 到 14.8 g/L 的 高 产 率 ；而 胞 内 表 达 的 羟 腈 裂 合 酶 达 到 了 22 g/L 的 高 产 率[3]。
关键词： 毕赤酵母 重组蛋白质 分离 纯化
Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in Pichia pastoris Expression System
Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting
表 1 依据蛋白特性采用的分离纯化方法
! & !
(IEC) (GFC) (HIC)(RPC)
!(AC)"#$% !(IMAC) ’()*+ (EBA)
2.1 离子交换 离 子 交 换 色 谱 （Ion Exchange Chromatography，
亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。 根据配体与生物大分子之间相互 作用体系不同， 可以把亲和层析分为生物亲和层 析、免疫亲和层析、金属离子螯合层析、拟生物亲和 层析 4 种 类型[17]。 固定化金属螯合 层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC） 是 近 年 来 发 展 起 来 的 一 种 亲 和 方 法 。 1975 年 ，Porath[18]首 次 wenku.baidu.com 出 固 定 化 金 属 螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）， 并 发 展 为 一 种 有 效的生化分离技术，该方法利用固定在基质上的过 渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、 半胱氨酸、 色氨酸等残基的配位作用来实现对金属离子有亲 和 力 的 蛋 白 质 分 离[19]。 其 中 ，组 氨 酸 是 与 金 属 离 子 作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在 IMAC 中 有 效 保 留 ， 故 多 聚 组 氨 酸 已 成 为 最 常 用 的 蛋 白 质 纯 化 标 签[20，21]。 真 核 表 达 体 系 中 的 毕 赤 酵 母 载体就加入了组氨酸标记，这为应用固定化金属螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）提 供 了 方 便 。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。