目的基因导入受体细
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转化进来的外源DNA编码的基因， 能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突 变体发生体内抑制或互补效应，从而 使被转化的寄主细胞表现出外源基因 编码的表型特征。
目的基因导入受体细
1)限 制 酶 切
2)DNA重 组 无 DNA插 入
转染
外 源 DNA 有 DNA插 入
Βιβλιοθήκη Baidu
无色噬菌斑
筛选重组噬菌体
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
目的基因导入受体细
利 用 噬 菌 斑 颜 色 筛 选 重 组 子
目的基因导入受体细
一、遗传检测法
2、根据插入序列的表型特征选择重 组体分子的直接选择法
目的基因导入受体细
目的基因导入受体细
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
由于E.coli不会自发地产生感受态，因此 E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是 将E.coli用冷CaCl2(0℃) 致敏，而后在高温
（42 ℃）下热休克，这样可使外原DNA进 入受体细胞。
目的基因导入受体细
• E.coli的电穿孔转化
在高压电场下使细胞产生瞬间的 穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够 的时间，使外原DNA进入受体细胞。 电穿孔法的转化效率比钙转化法高 2~3个数量级。这种方法也可用于真 核生物的转染。
柯斯载体DNA经体外包装成具有感染 能体力的λ噬菌体颗粒，然后经由在 受体细胞表面上的λDNA接受位点， 使这些带有目的基因序列的重组体 DNA注入大肠杆菌。
目的基因导入受体细
• 真核生物的转染
1. 磷酸钙转染技术 2.电穿孔法 3.基因抢转染法 4.激光微束穿孔法 5.显微注射法 6.脂质体介导法 7.多聚物介导法
• 多聚物介导法：用于动物细胞或植物的 原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺 乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖 氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、 DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞 饮作用而进入细胞内。
目的基因导入受体细
重组子分子的选择与鉴定
一、遗传检测法 二、物理检测法 三、菌落或噬菌斑杂交筛选法、 四、根据重组子结构特征筛选法 五、免疫化学检测法 六、蛋白质筛选法 七、转译筛选法
目的基因导入受体细
一、遗传检测法
1、根据载体表型特征选择重组体分子的 直接选择法 （1）抗药性标记插入失活选择法 （2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
目的基因导入受体细
抗药性标记插入失活
目的基因导入受体细
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
目的基因导入受体细
• 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔 法一样，主要用于植物细胞的转染。
• 基因抢转染法：主要用于植物细胞的 转染。利用被电场或机械加速的金属 微粒能够进入细胞内的基本原理，先 将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起 保温，使DNA吸附在金属微粒表面， 随高速的金属微粒直接进入细胞内。
目的基因导入受体细
• 激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线 粒体的基因工程操作。利用直径很小、 能量很高的激光束在细胞表面引起可逆 性的穿孔，使DNA进入细胞。
• 显微注射法：主要用于动物细胞或植物 的原生质体，利用毛细管直接将DNA 注入细胞内。
目的基因导入受体细
• 脂质体（liposome）介导法：主要用于 动物细胞或植物的原生质体。将DNA包 裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结 构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将 DNA导入细胞内。
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs
阳性菌落
提 取 DNA 电泳
筛 选 重 组 子 A m p r T c s 的 示 意 图
Ampr Tcs
重 组 DNA
目的基因导入受体细
β-半乳糖苷酶显色反应
应用载体系列，外源DNA插入到它的lacZ 基因所造成的β-半乳糖苷酶失活效应，可以 通过大肠杆菌转化子菌落或噬菌斑在XgalIPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。 β-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄 糖。 Xgal(5-溴-4-氯- 3-吲哚-β-D-半乳糖苷) IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
目的基因导入受体细
无 DNA插 入
Ap r
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
Apr
转化
Ap r
外 源 DNA 有 DNA插 入
Ap r
筛选重组子
白色菌落
Apr
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA 目A 的p基因r 导入受体细
利 用 菌 落 颜 色 筛 选 重 组 子
第五章 目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细
重组子分子导入受体细胞的途径
• 原核生物的转化与转染 • 真核生物的转染
目的基因导入受体细
• 原核生物的转化与转染
1. E.coli的钙转化
2. E.coli的电穿孔转化
3. 转染 4. 转导
目的基因导入受体细
• E.coli的钙转化
细菌细胞在一定的生理状态（感受态）， 或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况 下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性可 将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载 体的遗传工程一般使用这种方法。
目的基因导入受体细
• 磷酸钙转染技术 主要用于动物细胞的转染。将DNA
溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡 下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的 磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并 将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入 到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA 导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加 细胞的通透性，一方面可以避免DNA被 细胞内的核酸酶水解。
目的基因导入受体细
• 转染是指转化感染（Transfection来自 于transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为 载体，以转化的方法将DNA导入细胞 的方法均称为转染。因此转染就方法 来说与转化是一样的。
目的基因导入受体细
• 体外包装颗粒的转导 将重组的 λ噬菌体DNA或重组的
目的基因导入受体细
1)限 制 酶 切
2)DNA重 组 无 DNA插 入
转染
外 源 DNA 有 DNA插 入
Βιβλιοθήκη Baidu
无色噬菌斑
筛选重组噬菌体
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA
目的基因导入受体细
利 用 噬 菌 斑 颜 色 筛 选 重 组 子
目的基因导入受体细
一、遗传检测法
2、根据插入序列的表型特征选择重 组体分子的直接选择法
目的基因导入受体细
目的基因导入受体细
pU C 18
H in d II I S p h I P stI S a lI X b a I B a m H I S m a I K p n I S a c I E c o R I
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
由于E.coli不会自发地产生感受态，因此 E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是 将E.coli用冷CaCl2(0℃) 致敏，而后在高温
（42 ℃）下热休克，这样可使外原DNA进 入受体细胞。
目的基因导入受体细
• E.coli的电穿孔转化
在高压电场下使细胞产生瞬间的 穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够 的时间，使外原DNA进入受体细胞。 电穿孔法的转化效率比钙转化法高 2~3个数量级。这种方法也可用于真 核生物的转染。
柯斯载体DNA经体外包装成具有感染 能体力的λ噬菌体颗粒，然后经由在 受体细胞表面上的λDNA接受位点， 使这些带有目的基因序列的重组体 DNA注入大肠杆菌。
目的基因导入受体细
• 真核生物的转染
1. 磷酸钙转染技术 2.电穿孔法 3.基因抢转染法 4.激光微束穿孔法 5.显微注射法 6.脂质体介导法 7.多聚物介导法
• 多聚物介导法：用于动物细胞或植物的 原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺 乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖 氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、 DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞 饮作用而进入细胞内。
目的基因导入受体细
重组子分子的选择与鉴定
一、遗传检测法 二、物理检测法 三、菌落或噬菌斑杂交筛选法、 四、根据重组子结构特征筛选法 五、免疫化学检测法 六、蛋白质筛选法 七、转译筛选法
目的基因导入受体细
一、遗传检测法
1、根据载体表型特征选择重组体分子的 直接选择法 （1）抗药性标记插入失活选择法 （2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
目的基因导入受体细
抗药性标记插入失活
目的基因导入受体细
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
目的基因导入受体细
• 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔 法一样，主要用于植物细胞的转染。
• 基因抢转染法：主要用于植物细胞的 转染。利用被电场或机械加速的金属 微粒能够进入细胞内的基本原理，先 将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起 保温，使DNA吸附在金属微粒表面， 随高速的金属微粒直接进入细胞内。
目的基因导入受体细
• 激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线 粒体的基因工程操作。利用直径很小、 能量很高的激光束在细胞表面引起可逆 性的穿孔，使DNA进入细胞。
• 显微注射法：主要用于动物细胞或植物 的原生质体，利用毛细管直接将DNA 注入细胞内。
目的基因导入受体细
• 脂质体（liposome）介导法：主要用于 动物细胞或植物的原生质体。将DNA包 裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结 构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将 DNA导入细胞内。
无菌落
筛选重组子
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs
阳性菌落
提 取 DNA 电泳
筛 选 重 组 子 A m p r T c s 的 示 意 图
Ampr Tcs
重 组 DNA
目的基因导入受体细
β-半乳糖苷酶显色反应
应用载体系列，外源DNA插入到它的lacZ 基因所造成的β-半乳糖苷酶失活效应，可以 通过大肠杆菌转化子菌落或噬菌斑在XgalIPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。 β-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄 糖。 Xgal(5-溴-4-氯- 3-吲哚-β-D-半乳糖苷) IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
目的基因导入受体细
无 DNA插 入
Ap r
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
Apr
转化
Ap r
外 源 DNA 有 DNA插 入
Ap r
筛选重组子
白色菌落
Apr
提 取 DNA 电泳
重 组 DNA 目A 的p基因r 导入受体细
利 用 菌 落 颜 色 筛 选 重 组 子
第五章 目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细
重组子分子导入受体细胞的途径
• 原核生物的转化与转染 • 真核生物的转染
目的基因导入受体细
• 原核生物的转化与转染
1. E.coli的钙转化
2. E.coli的电穿孔转化
3. 转染 4. 转导
目的基因导入受体细
• E.coli的钙转化
细菌细胞在一定的生理状态（感受态）， 或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况 下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性可 将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载 体的遗传工程一般使用这种方法。
目的基因导入受体细
• 磷酸钙转染技术 主要用于动物细胞的转染。将DNA
溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡 下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的 磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并 将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入 到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA 导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加 细胞的通透性，一方面可以避免DNA被 细胞内的核酸酶水解。
目的基因导入受体细
• 转染是指转化感染（Transfection来自 于transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为 载体，以转化的方法将DNA导入细胞 的方法均称为转染。因此转染就方法 来说与转化是一样的。
目的基因导入受体细
• 体外包装颗粒的转导 将重组的 λ噬菌体DNA或重组的