仪器分析实验报告

《仪器分析》

实验报告

姓名：黄源铭

学号：3170530144

组别：15

专业：2017级检验技术（2018-2019学年第二学期）

年级、专业：2017级医学检验技术组别：15 学号：3170530144 姓名：黄源铭

合作者：黄秋汝实验日期：2019.5. 6

实验项目：

一、实验目的

(一) 掌握荧光光度法测定核黄素的原理和方法。

(二) 熟悉荧光光度计使用滤光片的选择方法。

(三) 掌握荧光光度计的使用

二、实验原理

三、实验步骤

四、实验记录和数据处理

一、发射波长的选择

480 490 500 510 512 514 516 518 520 522 524 Λem

（nm）

F s 4.6 12.3 22.7 32.4 33.4 34.1 34.4 34.3 33.9 33.2 32.3 F00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F s-F0 4.6 12.3 22.7 32.4 33.4 34.1 34.4 34.3 33.9 33.2 32.3

526 528 530 540 550 560 570 580

Λem

（nm）

F s31.1 29.7 28.2 21.5 15.6 11.2 7.6 4.8

F00 0 0 0 0 0 0 0

F s-F031.1 29.7 28.2 21.5 15.6 11.2 7.6 4.8

作为正式测量用的发射波长λem（nm）为：516nm

二、标准曲线的绘制以及样品含量的测定

编号0 1 2 3 4 5 样品C B2（ug/ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.506 F 0 6.7 14.1 21.3 27.8 35.0 17.7 F-F00 6.5 13.7 20.7 27.0 34.0 17.7

样品中维生素B2浓度为5.06 ug/ml.

五、结果与讨论

选取维生素B2系列标准液中维生素B2浓度最高的一瓶以及最高和最低的一瓶，利用荧光光度计分别测定其在不同发射波长的荧光强度Fs与F0。由实验原始记录数据得到，其作为正式测量用的发射波长λem（nm）为516nm。

选取此λem将其设为测定样品含量的发射波长，再次利用荧光光度计测定五瓶溶液的荧光强度。之后设立维生素B2浓度为横坐标，Fs-F0为纵坐标绘制测定维生素B2浓度的标准曲线。

由标准曲线计算可得，CB2=5.06 ug/ml。

实验过程较为顺利。吸取了上次定容时加入试剂过快，导致容量瓶中出现较多气泡，导致定容不准的失误，较好地完成了配制溶液的任务。希望在之后的实验中能够纠正自己更多实验操作上的不足，提高自己的实验操作能力。

六、思考题

1.荧光光度计和紫外可见光度计在仪器结构上有哪些不同之处？

光源：荧光光度计一般采用氚灯作光源

紫外可见光度计在紫外区采用氢灯和氚灯，在可见区采用钨灯和卤钨灯

单色器：荧光光度计有两个单色器，一个为激发单色器，一个为发射单色器紫外可见光度计只有一个单色器

光源和检测器的分布：荧光光度计的光源和检测器呈直角分布

紫外可见光度计的则呈一条直线分布。

2.荧光光度计的第一和第二滤光片的作用各是什么？选择滤光片的原则是什么？

第一滤光片的作用：得到滤掉了不需要的光线后的单色光。

第二滤光片的作用：得到了除去了由溶剂、容器和杂质等引起的杂散光后的单色光。

选择滤光片的原则：

在成像端尽可能让荧光/发射光透过，同时完全阻挡激发光，获得最高的信噪比。尤其是对于多光子激发和全内反射显微镜的应用，微弱的噪声也会对成像效果造成很大的干扰，因此对信噪比的要求更高。

通常我们看滤光片的参数一般会看透射率光谱，但往往荧光相对于激发光的强度很弱，选择滤光片更需要参考阻挡深度光谱图——OD值。OD值更能直观地反映滤光片对光的阻挡特性。

在选择激发滤光片和发射滤光片的时候，两者的阻挡深度光谱交点（OD 值交点）是重要的判断标准，一般要求宽场光源激发是交点OD值大于5，激光激发时大于OD6，以实现较好的荧光信噪比。