酵母多糖的分离提取

一．实验目的

1.初步了解微生物胞外多糖的概念。

2.学习并掌握显微操作技术及无菌操作技术。

3.掌握酵母菌株的摇瓶液体发酵技术。

4.学习微生物胞外多糖分离提取及测定的基本方法。

二．实验流程

菌株活化→液体种子培养→液体发酵培养→过程监测（形态、生物量、Ph、产物）

产物分离提取（上清、菌体）

培养基优化培养条件优化

三．实验材料

1.菌株：酵母菌

2.试剂：葡萄糖（AR）、酵母粉（BR）、蛋白胨（BR）、硫酸铵（AR）、丙三醇（AR）、

KH

2PO

4

（AR）、MgSO

4

`7H

2

0（AR）、3，5-二硝基水杨酸（CP）、NaOH（AR）、KOH

（AR）。

3.仪器设备：电热恒温培养箱、数显恒温摇床、压力蒸汽灭菌锅、低速离心机、

高速离心机、电子精密天平、Ph数显酸度计、电子恒温水浴锅、可见分光光度计、电脑型生物显微镜、超净工作台、旋转蒸发仪、气相色谱仪。

4.培养基

YPD培养基：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入2%琼脂粉。

种子培养基。葡萄糖10g，蛋白胨5 g，酵母膏15 g，氯化钠4g，pH7．0。

基础发酵培养基。葡萄糖20 g/L、硫酸铵8g/L、蛋白胨5g/L、KH

2P0

4

2.5 g/L、

MgSO

4·7H

2

0 0.5 g/L。

四．实验过程

1.条件优化及发酵培养

1.1.菌株活化

将保藏的菌株接种到固体平板培养。

1.2.制备种子液

进行液体种子培养，向装有150ml种子液体培养基的250ml的摇瓶中接入平板上的种子，30℃、150r/min震荡培养24h。

1.3.发酵培养

将活化好的种子液按培养条件的正交表接入100ml的基础发酵培养基，通过测定发酵培养条件的优化结果用于下一步的发酵培养基的优化。

1.4.培养优化

1.4.1.培养基的优化

温度、接种量、培养时间进行三水平三因素正交实验无交互作用。

1.4.

2.培养条件的优化

酵母发酵培养基的正交试验设计由葡萄糖、硫酸铵、KH

2P0

4

以及MgS04组成

发酵优化培养基，根据之前试验数据对每种成分设定4种水平，进行四因素四水平的正交实验，对培养基成分进一步优化，无交互作用。

1.5．发酵生产酵母多糖

将优化好的所有条件计算完成后按照优化好的培养基、培养条件发酵生产酵母多糖共生产400ml。

2.酵母多糖的分离提取及测定

2.1.试剂

氢氧化钾、35%醋酸、95%乙醇、丙酮、乙醚。

2.2．酵母胞壁多糖的提取工序

提取工艺路线为: 酵母悬液→冻融→超声波破碎→碱溶→中和→沉淀→洗涤→烘干。

1)酵母溶解:取发酵后的菌液10ml，3000rmin离心10min，取沉淀，将沉淀溶解

于25ml的容量瓶中。对上清液进行测定如果其中存在多糖则直接用菌液破壁提取多糖。

2)冻融: 将酵母沉淀置于- 20℃下冷冻2h, 再置于100℃水中骤然升温使其融

化, 如此反复3 次。

3)超声波破碎: 确定超声波破碎时间和功率,破碎最佳工艺参数是功率400～

500W、工作次数150 次，超声波开2s关1s。

4)碱溶: 确定碱浓度、温度、时间等条件,碱溶最佳工艺条件是碱液浓度3%、

温度100℃、时间1.5h。

5)中和: 室温放冷, 用醋酸中和至pH 值为6～7, 置于3 500r/min离心机中离

心10 min，静置, 收集上清夜。

6)沉淀: 以95%乙醇作沉淀剂, 沉淀12h, 乙醇与上清液的体积比为2: 1。

7)洗涤: 沉淀用丙酮洗涤2 次, 用乙醚洗涤1 次。

8)烘干: 30℃下干燥12h。

2.3.多糖的测定

苯酚硫酸法

2.3.1试剂

a)浓硫酸：分析纯，95.5%

b)80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中

避光长期储存。

c)6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

d)标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

2.3.2操作

a)制作标准曲线

准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，

分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，沸水浴显色15min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

b)样品含量测定

称取酵母粗多糖置20ml具塞试管中定容-摇匀，吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。