吴序栎-牛乳过敏原蛋白检测及降低蛋白致敏性的研究进展
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2. Bock SA, et al. Fatalities due to anaphylactic reactions to foods. J Allergy Clin Immunol. 2001 ,107(1):191-3.
牛乳过敏原的检测
发达国家开始强制实施八大类食物ຫໍສະໝຸດ Baidu敏原标签法规；
日本
美国
规定了对鸡蛋、牛奶、小麦、 规定了对于含有牛奶、蛋类、
6:3D11 7:4C3 8:4A7 9:阴性对照
8株单克隆的纯度较高；8株抗体均与牛乳βLG反应。
(2) 抗体亚类的鉴定
(3)单克隆抗体的效价测定
吸光值（OD）
吸光值（OD）
1.6
1.2
IgG1
IgG2a
0.8
IgE
IgA
0.4
IgM
0 1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 单克隆抗体名称
荞麦、花生等五种食物为原 鱼类、贝壳、坚果、花生、
料的加工食品和添加物，必 小麦、大豆等8类食品过敏原
须在容器和包装上注明所含 的食品，食品生产商或包装
的过敏性物质 。
商必须在食品包装标签上明
示
欧盟
除了牛奶等上述8类 过敏源外，还包括芹 菜、芥菜、芝麻和二 氧化硫或亚硫酸盐。
因此，建立一种可 靠、快速、灵敏、 特异、确切的牛乳 过敏原成分检测方 法十分必要。
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0 1000
10000
100000
单抗滴度
1000000
1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 Negative
10000000
图2-3单抗亚类鉴定
图2-4 抗牛乳βLG单克隆抗体效价测定
1G5，1F9，1H8，2H9，3G1，3D11，4C3和4A7均为IgG1类免疫球蛋白 1G5效价在1：100 000，其他抗体的效价在1:2 000 000以上。
图4-3 最佳包被抗体浓度的确定
0
1000 500 250 125 63
31
16
抗原浓度 (ng/mL)
图 4-4 最佳标记抗体浓度的确定
确定：以1H8作为包被抗体，稀释倍数为1:2 000； 标记生物素的1G5为检测抗体作为配对抗体，稀释倍数为1:5 000。
（2）检测βLG的双单抗夹心ELISA法
P/N P/N
（1）双抗体夹心法抗体配对
30
25
20
15
10
5
0
1H8
4C3
1G5
包被单抗隆抗体名称
20
18
16
14
12 Bio-1H8
Bio-4C3
10
Bio-1G5
8
6
4
2
0
1H8
4C3
1G5
包被单抗隆抗体名称
Bio-1H8 Bio-4C3 Bio-1G5
图4-1 最佳抗体配对实验（检测蛋白为βLG） 图4-2 最佳抗体配对实验（检测蛋白为牛乳粗蛋白）
导致死亡人数 40 6 3 1 1 1 1 1 1 1 4 1 2
FDA:通过食品标签， 避免摄入含过敏原成分
美国食物过敏导致死亡的病例的报道
1. Bock SA, et al. Further fatalities caused by anaphylactic reactions to food, 2001-2006. J Allergy Clin Immunol. 2007 ,119(4):1016-8.
C- ELISA(Rabbit polyclonal antiserum)
C- ELISA(Mouse polyclonal antiserum)
C- ELISA(Sheep polyclonal antiserum)
αLA
βLG
CNs
β-CN
αLA βLG
αLA βLG
αLA βLG
αLA βLG
确定：以1H8作为包被抗体，1G5为检测抗体作为配对抗体。
（1）双抗体夹心法抗体配对
25 25
20
20
1:1000
1:5000
1:1000
1:10000
1:2000
1:20000
15
1:4000
15
1:8000
10
10
P/N
P/N
5
5
0
1000 500 250 125
63
31
16
抗原浓度 (ng/mL)
(4)检测抗βLG单克隆抗体的交叉性
2
1.6
吸光值（OD）
1.2
0.8
0.4
0
1G5
1F9
1H8
2H9
3G1
3D11
4C3
4A7
单克隆抗体名称
1.6
1.2
吸光值（OD）
0.8
0.4
0
1G5
1F9
1H8
2H9
3G1
3D11
4C3
单克隆抗体名称
βLG CN ALA BSA 牛乳蛋白粗提物
牛乳 花生 鸡蛋 鱼 虾 腰果 小麦 大豆
美国FDA召回奥利奥饼干
n FDA召回奥利奥饼干的原因，是其 产品中含有牛奶成分，而在外包装 上并没有与此有关的任何标识
n 可危害生命
Million Tons
中国国内并没有强制对食品进行过敏原标签化管理
35.0% 30.0% 25.0% 20.0% 15.0% 10.0%
5.0% 0.0%
Milk Production
4A7
图2-5 抗牛乳βLG单克 隆抗体的与牛乳其他主
要过敏原交叉性研究
图2-6抗牛乳βLG单克 隆抗体与其他食物主要
过敏原的交叉性研究
8株单克隆抗体的特 异性强
抗牛乳βLG单克隆抗体与βLG结合区域的确定
合成四段主要抗 原表位多肽
ELISA反应
Immuno dot-blotting反应
鉴定抗体与βLG结合区域
5×103 µg kg-1 13 µg L-1 27µg L-1
Fremont et al. (1996) Makinen-kiljunen (1992) Hefle (2004) Anguita (1997)
Pomes et al. (2003)
0.08µg L-1
Mariager et al. (1994)
牛乳过敏引起：皮肤、呼吸道、胃肠道症状及全身性的症状(如过敏性昏厥等)
Sampson HA. Update on food allergy[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(5):805–819. Sicherer SH, Munoz-Furlong A, Sampson HA. Prevalence of food allergy in the United States determined by a random telephone survey[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 114(1):159–165.
牛乳过敏
食物过敏原名称 Peanut(花生) Nuts（坚果）
Walnut（胡桃） Almond（杏仁） Hazelnut（榛子） Tree nut（欧洲榛 ） Brazil nut（巴西榛） Pecan（ 美洲山核桃） Pistachio（阿月浑子果）
Fish（鱼） Milk（牛奶） Milk/whey（乳清） Shrimp（虾）
2018农产品加工贮藏学术年会
牛乳过敏原蛋白检测 及降低蛋白致敏性的研究进展
深圳大学 吴序栎
2018.11
一、研究背景
民以食为天，食以安为先。
食物中毒
营养不平衡 慢性退行性疾病
食源性 肠道传染病
食源性疾病
污染物 慢性中毒
食源性 寄生虫病
食品过敏
牛乳过敏
Ø 食物过敏是一种至今尚无有效防治方法的病症； Ø 避免摄入含过敏原成分是预防食物过敏性疾病的有效途径之一； Ø 牛乳及牛乳制品是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一； Ø 婴幼儿牛乳过敏的发生率约为2%-6%，成年人约为0.1%-0.5%。
3.2 µg L-1
Mariager et al. (1994)
144 µg L-1 450 µg kg-1 2×103 µg L-1
Mariager et al(1994)
Muller-Renaud (2003)
Indyk et al. (2005)
Ø是牛乳主要过敏原之一；
βLG作为检测的理想标志物 Ø具有热稳定性，耐酶切，一般加工对其影响小；
Annual Growth Rate 28.4%
19.3% 18.0%
13.3%
22.8% 17.9% 13.8% 9.4%
3.4%
1.5% 2.4% 3.1%
40 35 30 25 20 15 4.4% 10
-5.0%
-3.8%
5 -6.0%
-10.0%
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
图1-1 Temporal trends in dairy product yields in China (1999–2014).
Wu XL et al. Trends in Food Science & Technology, 2010,21(1): 44-51 Wu XL et al. Trends in Food Science & Technology, 2018, 76: 6-14.
SPR Biosemor
κ-CN
SPR Biosemo
LF lactoferrin
冰淇淋、巧克力、 糖果、热狗 儿童食品
婴幼儿奶粉、人乳 不含牛乳食品 乳制品 牛乳
低至敏婴儿奶粉 低至敏婴儿奶粉
低至敏婴儿奶粉
牛乳
牛乳
25-100×103 µg L-1 Yman et al. (1994)
1×103 µg kg-1 0.02 µg L-1 500 µg kg-1
Ø含量占牛乳总蛋白10%。
β-乳球蛋白(简称βLG）的主要生物信息学信息
牛乳中最主要的过敏原（营养价值高、在食品工业中广泛使用）
图1-1βLG三级结构上主要IgE表位示意图（标有颜色部分为IgE的主要表位）
图1-2 βLG三级结构上主要IgG表位示意图（标有颜色部分为IgG的主要表位）
二 研究内容：牛乳过敏原蛋白的检测
表位鉴定结果
2
吸光值（OD）
1.6
βLG
51Glu-64Asp
1.2
67Arg-88Asn
129Asp-144Pro
0.8
139Arg-150Thr
CNs
0.4
0 1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 单克隆抗体名称
图 3-1 ELISA检测不同抗βLG单抗识别的主要抗原表位
图3-2 表位鉴定Immuno dot-blotting实验
基于牛乳βLG免疫反应性建立检测食物中牛乳βLG成分的方法
已知表 位单抗
抗体 配对
快速筛查
胶体金免疫层析 法（GICA）
常规检测 高灵敏度检测
酶联免疫吸附法 （ELISA）
等离子共振 （SPR）
确证检测
免疫印迹法 （WB）
建立 食品 中牛 乳过 敏原 成分 检测 体系
牛乳过敏原的检测（研究进展）
方法
表1-1 非商用的牛乳过敏原成分检测方法 Table 1-1 Non-commercial assays for the detection of milk allergens
检测目标 蛋白
检测对象
检出限LOD
参考文献
RIE
CNs
RAST Inhibition S-ELISA S-ELISA C- ELISA C- ELISA
European Parliament and Council, 2003 European Parliament and Council, Directive 2003/89/EC of 10 November 2003 amending Directive 2000/13/EC as regards indication of the ingredients present in foodstuffs, Official Journal of the European Communities L308 (2003), pp. 15–18. Food and Drug Administration (FDA), 2004 Food and Drug Administration (FDA). (2004). Food allergen labeling and consumer protection act of, 2 August 2004.
以β-乳球蛋白(简称βLG）为检测标志物
（1）单克隆抗体的纯度检测及WB鉴定
图2-1 抗体纯度鉴定电泳图 M：标准蛋白1:1G5 2:1F9 3:1H8 4:2H9 5:3G1
6:3D11 7:4C3 8:4A7
图2-2 抗牛乳βLG单克隆抗体的免疫印迹鉴定 M：蛋白标志物1:1G5 2:1F9 3:1H8 4:2H9 5:3G1
标准曲线在1.6 ng mL-1～50 ng mL-1范围 内线性良好
检出限约为1.6 ng mL-1。
TMB显色
牛乳过敏原的检测
发达国家开始强制实施八大类食物ຫໍສະໝຸດ Baidu敏原标签法规；
日本
美国
规定了对鸡蛋、牛奶、小麦、 规定了对于含有牛奶、蛋类、
6:3D11 7:4C3 8:4A7 9:阴性对照
8株单克隆的纯度较高；8株抗体均与牛乳βLG反应。
(2) 抗体亚类的鉴定
(3)单克隆抗体的效价测定
吸光值（OD）
吸光值（OD）
1.6
1.2
IgG1
IgG2a
0.8
IgE
IgA
0.4
IgM
0 1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 单克隆抗体名称
荞麦、花生等五种食物为原 鱼类、贝壳、坚果、花生、
料的加工食品和添加物，必 小麦、大豆等8类食品过敏原
须在容器和包装上注明所含 的食品，食品生产商或包装
的过敏性物质 。
商必须在食品包装标签上明
示
欧盟
除了牛奶等上述8类 过敏源外，还包括芹 菜、芥菜、芝麻和二 氧化硫或亚硫酸盐。
因此，建立一种可 靠、快速、灵敏、 特异、确切的牛乳 过敏原成分检测方 法十分必要。
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0 1000
10000
100000
单抗滴度
1000000
1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 Negative
10000000
图2-3单抗亚类鉴定
图2-4 抗牛乳βLG单克隆抗体效价测定
1G5，1F9，1H8，2H9，3G1，3D11，4C3和4A7均为IgG1类免疫球蛋白 1G5效价在1：100 000，其他抗体的效价在1:2 000 000以上。
图4-3 最佳包被抗体浓度的确定
0
1000 500 250 125 63
31
16
抗原浓度 (ng/mL)
图 4-4 最佳标记抗体浓度的确定
确定：以1H8作为包被抗体，稀释倍数为1:2 000； 标记生物素的1G5为检测抗体作为配对抗体，稀释倍数为1:5 000。
（2）检测βLG的双单抗夹心ELISA法
P/N P/N
（1）双抗体夹心法抗体配对
30
25
20
15
10
5
0
1H8
4C3
1G5
包被单抗隆抗体名称
20
18
16
14
12 Bio-1H8
Bio-4C3
10
Bio-1G5
8
6
4
2
0
1H8
4C3
1G5
包被单抗隆抗体名称
Bio-1H8 Bio-4C3 Bio-1G5
图4-1 最佳抗体配对实验（检测蛋白为βLG） 图4-2 最佳抗体配对实验（检测蛋白为牛乳粗蛋白）
导致死亡人数 40 6 3 1 1 1 1 1 1 1 4 1 2
FDA:通过食品标签， 避免摄入含过敏原成分
美国食物过敏导致死亡的病例的报道
1. Bock SA, et al. Further fatalities caused by anaphylactic reactions to food, 2001-2006. J Allergy Clin Immunol. 2007 ,119(4):1016-8.
C- ELISA(Rabbit polyclonal antiserum)
C- ELISA(Mouse polyclonal antiserum)
C- ELISA(Sheep polyclonal antiserum)
αLA
βLG
CNs
β-CN
αLA βLG
αLA βLG
αLA βLG
αLA βLG
确定：以1H8作为包被抗体，1G5为检测抗体作为配对抗体。
（1）双抗体夹心法抗体配对
25 25
20
20
1:1000
1:5000
1:1000
1:10000
1:2000
1:20000
15
1:4000
15
1:8000
10
10
P/N
P/N
5
5
0
1000 500 250 125
63
31
16
抗原浓度 (ng/mL)
(4)检测抗βLG单克隆抗体的交叉性
2
1.6
吸光值（OD）
1.2
0.8
0.4
0
1G5
1F9
1H8
2H9
3G1
3D11
4C3
4A7
单克隆抗体名称
1.6
1.2
吸光值（OD）
0.8
0.4
0
1G5
1F9
1H8
2H9
3G1
3D11
4C3
单克隆抗体名称
βLG CN ALA BSA 牛乳蛋白粗提物
牛乳 花生 鸡蛋 鱼 虾 腰果 小麦 大豆
美国FDA召回奥利奥饼干
n FDA召回奥利奥饼干的原因，是其 产品中含有牛奶成分，而在外包装 上并没有与此有关的任何标识
n 可危害生命
Million Tons
中国国内并没有强制对食品进行过敏原标签化管理
35.0% 30.0% 25.0% 20.0% 15.0% 10.0%
5.0% 0.0%
Milk Production
4A7
图2-5 抗牛乳βLG单克 隆抗体的与牛乳其他主
要过敏原交叉性研究
图2-6抗牛乳βLG单克 隆抗体与其他食物主要
过敏原的交叉性研究
8株单克隆抗体的特 异性强
抗牛乳βLG单克隆抗体与βLG结合区域的确定
合成四段主要抗 原表位多肽
ELISA反应
Immuno dot-blotting反应
鉴定抗体与βLG结合区域
5×103 µg kg-1 13 µg L-1 27µg L-1
Fremont et al. (1996) Makinen-kiljunen (1992) Hefle (2004) Anguita (1997)
Pomes et al. (2003)
0.08µg L-1
Mariager et al. (1994)
牛乳过敏引起：皮肤、呼吸道、胃肠道症状及全身性的症状(如过敏性昏厥等)
Sampson HA. Update on food allergy[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(5):805–819. Sicherer SH, Munoz-Furlong A, Sampson HA. Prevalence of food allergy in the United States determined by a random telephone survey[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 114(1):159–165.
牛乳过敏
食物过敏原名称 Peanut(花生) Nuts（坚果）
Walnut（胡桃） Almond（杏仁） Hazelnut（榛子） Tree nut（欧洲榛 ） Brazil nut（巴西榛） Pecan（ 美洲山核桃） Pistachio（阿月浑子果）
Fish（鱼） Milk（牛奶） Milk/whey（乳清） Shrimp（虾）
2018农产品加工贮藏学术年会
牛乳过敏原蛋白检测 及降低蛋白致敏性的研究进展
深圳大学 吴序栎
2018.11
一、研究背景
民以食为天，食以安为先。
食物中毒
营养不平衡 慢性退行性疾病
食源性 肠道传染病
食源性疾病
污染物 慢性中毒
食源性 寄生虫病
食品过敏
牛乳过敏
Ø 食物过敏是一种至今尚无有效防治方法的病症； Ø 避免摄入含过敏原成分是预防食物过敏性疾病的有效途径之一； Ø 牛乳及牛乳制品是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一； Ø 婴幼儿牛乳过敏的发生率约为2%-6%，成年人约为0.1%-0.5%。
3.2 µg L-1
Mariager et al. (1994)
144 µg L-1 450 µg kg-1 2×103 µg L-1
Mariager et al(1994)
Muller-Renaud (2003)
Indyk et al. (2005)
Ø是牛乳主要过敏原之一；
βLG作为检测的理想标志物 Ø具有热稳定性，耐酶切，一般加工对其影响小；
Annual Growth Rate 28.4%
19.3% 18.0%
13.3%
22.8% 17.9% 13.8% 9.4%
3.4%
1.5% 2.4% 3.1%
40 35 30 25 20 15 4.4% 10
-5.0%
-3.8%
5 -6.0%
-10.0%
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
图1-1 Temporal trends in dairy product yields in China (1999–2014).
Wu XL et al. Trends in Food Science & Technology, 2010,21(1): 44-51 Wu XL et al. Trends in Food Science & Technology, 2018, 76: 6-14.
SPR Biosemor
κ-CN
SPR Biosemo
LF lactoferrin
冰淇淋、巧克力、 糖果、热狗 儿童食品
婴幼儿奶粉、人乳 不含牛乳食品 乳制品 牛乳
低至敏婴儿奶粉 低至敏婴儿奶粉
低至敏婴儿奶粉
牛乳
牛乳
25-100×103 µg L-1 Yman et al. (1994)
1×103 µg kg-1 0.02 µg L-1 500 µg kg-1
Ø含量占牛乳总蛋白10%。
β-乳球蛋白(简称βLG）的主要生物信息学信息
牛乳中最主要的过敏原（营养价值高、在食品工业中广泛使用）
图1-1βLG三级结构上主要IgE表位示意图（标有颜色部分为IgE的主要表位）
图1-2 βLG三级结构上主要IgG表位示意图（标有颜色部分为IgG的主要表位）
二 研究内容：牛乳过敏原蛋白的检测
表位鉴定结果
2
吸光值（OD）
1.6
βLG
51Glu-64Asp
1.2
67Arg-88Asn
129Asp-144Pro
0.8
139Arg-150Thr
CNs
0.4
0 1G5 1F9 1H8 2H9 3G1 3D11 4C3 4A7 单克隆抗体名称
图 3-1 ELISA检测不同抗βLG单抗识别的主要抗原表位
图3-2 表位鉴定Immuno dot-blotting实验
基于牛乳βLG免疫反应性建立检测食物中牛乳βLG成分的方法
已知表 位单抗
抗体 配对
快速筛查
胶体金免疫层析 法（GICA）
常规检测 高灵敏度检测
酶联免疫吸附法 （ELISA）
等离子共振 （SPR）
确证检测
免疫印迹法 （WB）
建立 食品 中牛 乳过 敏原 成分 检测 体系
牛乳过敏原的检测（研究进展）
方法
表1-1 非商用的牛乳过敏原成分检测方法 Table 1-1 Non-commercial assays for the detection of milk allergens
检测目标 蛋白
检测对象
检出限LOD
参考文献
RIE
CNs
RAST Inhibition S-ELISA S-ELISA C- ELISA C- ELISA
European Parliament and Council, 2003 European Parliament and Council, Directive 2003/89/EC of 10 November 2003 amending Directive 2000/13/EC as regards indication of the ingredients present in foodstuffs, Official Journal of the European Communities L308 (2003), pp. 15–18. Food and Drug Administration (FDA), 2004 Food and Drug Administration (FDA). (2004). Food allergen labeling and consumer protection act of, 2 August 2004.
以β-乳球蛋白(简称βLG）为检测标志物
（1）单克隆抗体的纯度检测及WB鉴定
图2-1 抗体纯度鉴定电泳图 M：标准蛋白1:1G5 2:1F9 3:1H8 4:2H9 5:3G1
6:3D11 7:4C3 8:4A7
图2-2 抗牛乳βLG单克隆抗体的免疫印迹鉴定 M：蛋白标志物1:1G5 2:1F9 3:1H8 4:2H9 5:3G1
标准曲线在1.6 ng mL-1～50 ng mL-1范围 内线性良好
检出限约为1.6 ng mL-1。
TMB显色