第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
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基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
噬菌体
包装容量
• λ噬菌体载体可插入长 噬菌体载体可插入长5-20kb的外来 的外来DNA，这 噬菌体载体可插入长 的外来 ， 比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装 长得多； 比质粒载体能插入的 长得多 的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建 效率高得比质粒载体复杂。 • 理论上的极限值可达 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有 ， 效的克隆范围仅为15kb左右 效的克隆范围仅为 左右
（3）外源片断与载体的连接 ） • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 联体，以利于将两个cos位点之间的片断 联体，以利于将两个 位点之间的片断 装入噬菌体颗粒
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染 ）重组噬菌体的体外包装， 力的噬菌体颗粒 • 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 利用特殊材料， • 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成 连接产物与包装蛋白混合时， 包装反应， 包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 • 包装蛋白对所包装的 包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选 大小有高度选 择性， 范围： 分子的75％－ ％ 择性， 范围：λDNA分子的 ％－ 分子的 ％－105％
基因克隆载体 (λ噬菌体载体 噬菌体载体) 噬菌体载体
• 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形， 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头 部和尾部两部分组成。 部和尾部两部分组成。 • 头部 核心：核酸（ 核心：核酸（DNA或RNA） 或 ） 衣壳：蛋白质， 衣壳：蛋白质，六边形立体对称 • 尾部 蛋白质 尾部( 蛋白质) 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、尾刺 与吸附宿主有关
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
基因工程4-2 (简要) 基因工程的载体
其中 BamH I 切点还可以连接经 Sau 3A 或 Mbo I部分消化的DNA片段，虽然在克隆过程 中载体上的 BamH I 位点被破坏了，但可以选 用EcoR I或Sal I作消化作用，便能回收到克隆 的外源DNA片段。
* 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌。 （即含有原噬菌体的寄主细胞）
* 原噬菌体 (prophage) ：在溶源性细菌内存在的整合或非 整合的噬菌体DNA（所谓整合是指噬菌体DNA已插入到 寄主细胞染色体DNA之中）。 溶源性细菌具有免疫性，能够不再受同种噬菌体的 侵染，这一现象称为超感染免疫性。
2. EMBL系列载体 是 一类 替 换型载 体，适 用于克 隆长度 为 8~23 的可取代区段的两 侧，各有一段切点相同、方向相反的多克隆位 点，能够被EcoR I、BamH I和Sal I所识别，因 而可用来克隆由这三类限制酶所产生的任何一 种限制片段。
DNA的复制在早期是按形式从双向进行 的，由一个环状分子复制成两个环状分子。若
进入裂解途径的晚期，则进行滚环复制，由一
个环状DNA分子复制成多个 DNA分子连在一
起的线状长多连体分子。
在噬菌体包装时， DNA的多连体分子经过
核酸酶的切割作用，从cos位点处将它分离成单
位长度的单体分子之后，才能够被包装起来。
3. DNA的包装限制问题： 噬菌体的包装能力，控制在野生型 DNA 长度的 75~105% 。在这个范围内的 DNA 可以被 包装成有活性的噬菌体颗粒，而超出这个范围 的就不能形成正常大小的噬菌斑。
用噬菌体作载体时，对外源DNA片段的大 小有比较严格的要求。若按野生型 DNA 分子 长度为48 kb计算，其包装上限为51 kb；由于野 生型的 DNA基因组中必要基因的DNA区段占 28 kb ，所以 载体克隆外源 DNA 片段的理论极 限值是23 kb。一般的载体的包装容量在15 kb 左右。
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
基因克隆的载体
3.常用的质粒载体
第二节 噬菌体载体（phage vectors）
噬菌体的生物学特性 噬菌体载体构建 M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
溶菌周期(lytic cycle)：
噬菌体将DNA注入 寄主细胞后很快环 化，然后进行自我 复制、蛋白衣壳合 成和新噬菌体颗粒 的组装，最后使寄 主细胞破裂而释放 出大量的子代噬菌 体。
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
引
一、基因克隆的本质
言
是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，
三个确保低拷贝质粒精确分
配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , ibrary）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入 相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组
cILytic cycle clear plaques
selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene
Replacement vectors(替换型载体)
4.M13噬菌体载体
（1）M13噬菌体增殖
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移%的mRNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的 n 比例 N：所需的重组载体数（克隆数）
动物基因工程—基因克隆载体
源DNA片段插人必需区
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
第4章 基因工程载体
的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。一种
理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选 择标记基因内有合适的克隆位点。常用的选择标记基因主要 是抗生素的抗性基因[如四环素抗性（Tetr或Tcr）、氨苄青霉 素抗性（Ampr或Apr）、卡那霉素抗性（Kanr或Kmr）、氯 霉素抗性（Cmlr或Cmr）、链霉素抗性（Strr或Smr）等]和β半乳糖甘酶基因。
（5）基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，
安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体 1977年，F. Bolivar和R. L. Rodriguez 构建了一个典型的用
于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用
白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是
双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链 RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差 可达上百倍。而且有些噬菌体的DNA碱基并不是标准的A、T、 C、G四种碱基组成。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）
导致Ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现
象，称之为插入失活效应。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
pUC质粒载体
1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的 科学家J. Messing 和J. Viria在pBR322质粒框架基础上构建
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
四、基因克隆载体(一)
把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并 在菌体内成功转录出相应的mRNA。 这是第一次成功的基因克隆实验。
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒
因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。
分子克隆常用载体
♪ T载体
pUCm-T质粒 图谱
pUCm-T载体序列
二、噬菌体载体
噬菌体的生命周期
♪ （1）溶菌生长周期噬菌体（烈性 噬菌体）
♪ （2）溶源生长周期噬菌体（温和 噬菌体）
（1）烈性噬菌体的生活周期
（2）温和噬菌体的生活周期
裂解循环
Hale Waihona Puke 溶源态重要的噬菌体载体
一、λ噬菌体载体
（1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入
分子克隆常用载体
理想的质粒载体必须具备的基本条件
♪ 1、具有复制起点 ♪ 2、具有抗菌素抗性基因 ♪ 3、具有若干限制酶单一识别位点 ♪ 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数
重要的大肠杆菌质粒载体
♪ pSC101质粒载体； ♪ ColE 1质粒载体； ♪ pBR322质粒载体； ♪ pUC质粒载体；
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因 ）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极 限可达45kb左右）；
（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
四、酵母细胞的克隆载体
♪1、整合型载体（YIP）
♪ YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。这类载体在细菌中复 制、扩增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体的特点是转化率低(只有110转化子/微克DNA)，但转化子遗传性 稳定，多用于遗传分析工作。
（2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之 间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。
体外包装：λ噬菌体载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
pUCm-T质粒 图谱
pUCm-T载体序列
二、噬菌体载体
噬菌体的生命周期
♪ （1）溶菌生长周期噬菌体（烈性 噬菌体）
♪ （2）溶源生长周期噬菌体（温和 噬菌体）
（1）烈性噬菌体的生活周期
（2）温和噬菌体的生活周期
裂解循环
Hale Waihona Puke 溶源态重要的噬菌体载体
一、λ噬菌体载体
（1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入
分子克隆常用载体
理想的质粒载体必须具备的基本条件
♪ 1、具有复制起点 ♪ 2、具有抗菌素抗性基因 ♪ 3、具有若干限制酶单一识别位点 ♪ 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数
重要的大肠杆菌质粒载体
♪ pSC101质粒载体； ♪ ColE 1质粒载体； ♪ pBR322质粒载体； ♪ pUC质粒载体；
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因 ）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极 限可达45kb左右）；
（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
四、酵母细胞的克隆载体
♪1、整合型载体（YIP）
♪ YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。这类载体在细菌中复 制、扩增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体的特点是转化率低(只有110转化子/微克DNA)，但转化子遗传性 稳定，多用于遗传分析工作。
（2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之 间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。
体外包装：λ噬菌体载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
第四章 基因克隆的质粒载体
2021/8/4
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
2021/8/4
2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
2021/8/4
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
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2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
2021/8/4
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
基因克隆的载体噬菌粒载体
3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用 少许大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量载体DNA；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第3页
4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第2页
常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
第4页
8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
第6页
pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第3页
4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第2页
常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
第4页
8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
第6页
pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；
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噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
Blue-white selection
M13载体系列的优点
1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷 酶基因片段（HindⅢ片段），其中插入了一段具 有密集的多克隆位点的序列；
2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。
M13mp18 MCS
第二节 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
2.1 噬菌体的一般生物特性
可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环
境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系， 从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
LA 32.7
λgt 10
cI EcoR I
RA10.6
LA 19.9
Charon 16A
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
EMBL3、DASH
外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感 染和复制非必要的片段 (～20 kb)
高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质 粒高 100倍)
这种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的，
有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成 的。
Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧 啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取 代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
2.1.2 噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%-105%。
由于λ噬菌体包装时，当DNA 的长度短于野生型的78%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧 下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75% ～ 105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体 DNA和外源DNA长度之和在 39～53kb之间。
插入式载体可携带的外源ＤＮ Ａ片段较替换式为小。
根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾 部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬 菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌 体则只能形成头部。
将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物 活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。
2.1.1 噬菌体的结构和其核酸类型
结构：无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、 线状体型
核酸类型：最常见的是双链线性DNA、 双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大 的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主 的依赖性较低。
M13噬菌体的特点
1.感染Ecoli后，在宿
主细胞内会形成双链 的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可 以象质粒DNA那样在 体外进行纯化和操作。
2.成熟的噬菌体颗粒仅能
感染E.coli的F+细胞，这
是因为这种噬菌体的感染 位点在性散毛上。但是无 论是RFDNA或ssDNA都
2.1.3 噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染 色体DNA上，成为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期
温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌 溶 源 化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程 整 合： 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种
替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
Charon 4A Lac
EcoR I EMBL3/4
Lac
EcoR I
EcoR I BanH I Sal I
Sal I BamH I EcoR I
Charon 40 Lac
MCS
MCS
替换型载体克隆外源DNA的步骤
1. 应用适当的核酸内切酶 消化λ载体，除去可取 代的DNA片段；
M13mp19 MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BP
B
P
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI
BamHI & PstI PB
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，
2. 将上述所得的 λDNA 载体臂同外源DNA片 段的连接；
3. 对重组体的λDNA分子 进行包装和增殖，以 得到有感染性的λ重组 噬菌体
2.连接
1.酶切 3.组装
4.侵染
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，
然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞
内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106～ 108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入 的频率仅为103～105/ μgDNA。
cI基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI基 因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将 导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原 化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
噬菌体P1基本特征
不存在噬菌体 DNA分子的整合作 用体系，而是变成 了一种进行独立复 制的环形的质粒 DNA分子。
溶源噬菌体的诱发
依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏 物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体 上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复 溶源周期开始时的状态。
（左右臂连接） （三段自身连接）
（插入片段）
根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选
2.3 单链DNA噬菌体载体(M13)
M13噬菌体载体
M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状 大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体 主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链Ｄ ＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列 （sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源 双链DNA的分析等。
能转染E.coli的F+或F-细
胞。
3.噬菌体颗粒的大 小是受其DNA的大 小制约的，这一点 正好与λ噬菌体相 反。所以M13噬菌 体并不存在包装限 制的问题。
M13 life cycle
M13载体
具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质 粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。
可以定向的克隆DNA片段，克隆在M13 RFDNA分子上的双链DNA 片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮ Ａ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知 道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外 源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全 取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源DNA分子 的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是 定向克隆技术。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
Blue-white selection
M13载体系列的优点
1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷 酶基因片段（HindⅢ片段），其中插入了一段具 有密集的多克隆位点的序列；
2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。
M13mp18 MCS
第二节 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
2.1 噬菌体的一般生物特性
可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环
境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系， 从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
LA 32.7
λgt 10
cI EcoR I
RA10.6
LA 19.9
Charon 16A
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
EMBL3、DASH
外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感 染和复制非必要的片段 (～20 kb)
高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质 粒高 100倍)
这种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的，
有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成 的。
Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧 啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取 代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
2.1.2 噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%-105%。
由于λ噬菌体包装时，当DNA 的长度短于野生型的78%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧 下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75% ～ 105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体 DNA和外源DNA长度之和在 39～53kb之间。
插入式载体可携带的外源ＤＮ Ａ片段较替换式为小。
根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾 部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬 菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌 体则只能形成头部。
将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物 活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。
2.1.1 噬菌体的结构和其核酸类型
结构：无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、 线状体型
核酸类型：最常见的是双链线性DNA、 双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大 的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主 的依赖性较低。
M13噬菌体的特点
1.感染Ecoli后，在宿
主细胞内会形成双链 的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可 以象质粒DNA那样在 体外进行纯化和操作。
2.成熟的噬菌体颗粒仅能
感染E.coli的F+细胞，这
是因为这种噬菌体的感染 位点在性散毛上。但是无 论是RFDNA或ssDNA都
2.1.3 噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染 色体DNA上，成为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期
温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌 溶 源 化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程 整 合： 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种
替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
Charon 4A Lac
EcoR I EMBL3/4
Lac
EcoR I
EcoR I BanH I Sal I
Sal I BamH I EcoR I
Charon 40 Lac
MCS
MCS
替换型载体克隆外源DNA的步骤
1. 应用适当的核酸内切酶 消化λ载体，除去可取 代的DNA片段；
M13mp19 MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BP
B
P
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI
BamHI & PstI PB
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，
2. 将上述所得的 λDNA 载体臂同外源DNA片 段的连接；
3. 对重组体的λDNA分子 进行包装和增殖，以 得到有感染性的λ重组 噬菌体
2.连接
1.酶切 3.组装
4.侵染
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，
然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞
内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106～ 108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入 的频率仅为103～105/ μgDNA。
cI基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI基 因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将 导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原 化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
噬菌体P1基本特征
不存在噬菌体 DNA分子的整合作 用体系，而是变成 了一种进行独立复 制的环形的质粒 DNA分子。
溶源噬菌体的诱发
依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏 物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体 上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复 溶源周期开始时的状态。
（左右臂连接） （三段自身连接）
（插入片段）
根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选
2.3 单链DNA噬菌体载体(M13)
M13噬菌体载体
M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状 大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体 主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链Ｄ ＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列 （sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源 双链DNA的分析等。
能转染E.coli的F+或F-细
胞。
3.噬菌体颗粒的大 小是受其DNA的大 小制约的，这一点 正好与λ噬菌体相 反。所以M13噬菌 体并不存在包装限 制的问题。
M13 life cycle
M13载体
具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质 粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。
可以定向的克隆DNA片段，克隆在M13 RFDNA分子上的双链DNA 片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮ Ａ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知 道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外 源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全 取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源DNA分子 的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是 定向克隆技术。