标记抗体技术

标记抗体技术

免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗

体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。

一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体

a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）

HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

HRP

DH2＋H2O2──────→D＋2H2O

b. 辣根过氧化物酶标记方法

酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，

硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。

二、免疫荧光标记技术

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。

常用荧光素：

FITC 吸收光谱490-495,发射光谱520-530nm,分子量389.4 黄绿色荧光

TMRITC吸收光谱550, 发射光谱620,橙红色荧光

TEXAS RED

吸收光谱590-595 ,发射光谱620-630nm,分子量625.15

SITS AMC 蓝色荧光澡红素R

花青

三、凝集素标记技术

凝集素是一类从各种植物种子和动物

组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其

能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集

素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维

细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常

以其提取的植物命名，如刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等，凝集素(Ietin)是其总称。日前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力．如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。

四、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是80 年代继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法以及免疫层析技术等。目前已广泛应用于临床诊断，尤其是在医学临床检验中的应用，如早孕、乙肝、寄生虫、性病和病毒细菌病的检测。而动物医学临床诊断方面的应用起步较晚，最近几年才偶有报道，但作为临床诊断试剂盒开发应用的还很少。该方法最大特点是单份测定、简单快速、特异敏感，像层析试纸条技术，不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。免疫胶体金层析技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。现就该技术的原理、方法和发展前景作一简要综述。

1.免疫胶体金技术原理：胶体金用于标记的原理胶体金是一种负电荷的疏水胶，靠静电粒子相互排斥作用来维持稳定的胶体体系，其颗粒散在、红色，直径从几纳米到几十纳米不等。由于不同直径的胶体金的光散射各异，所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化，这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。同时由于胶体金金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可与SPA ,IGg,毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合，从而使其成为免疫反应的优良标记物。而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银，因此在胶体金免疫测定时加入银染色液，能放大反应信号，大大增加测定的灵敏度。

胶体金颗粒带电情况抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）

2.免疫胶体金技术的应用现状胶体金用于免疫学检测研究是20世纪80年代发展起来的一项新技术，Muller 等1980年应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电镜研究，Geoghegan等(1980) 和Leuvering 等（1981）应用胶体金进行了被动凝集试验，Leuvering等（1983）利用胶体金做了早孕诊断研究。进入90 年代，免疫胶体金检测试剂开始在人体医学上逐渐研发应用，目前已有数十种检测试剂在临床上应用。而动物医学方面的检测起步较晚，近几年报道的较多，已经开始引起兽医界的重视。免疫金传统方法主要应用在被动凝集试验、免疫金电镜染色法、免疫金光镜染色法和胶体金染色免疫印迹法，目前应用较多的为斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法。现就这两项技术的应用作一介绍

1)斑点免疫金渗滤法（DIGFA）该技术主要应用微孔滤膜（NC 膜）作载体的免疫检测技术，先将抗原或抗体点于NC 膜上，封闭后加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。通过金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体NC 膜上显示出来。