第五章 植物原生质体的分离与培养
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
第五章 原生质体培养 PPT课件
来源
绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens
生产厂家
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
果胶酶类
Macerozyme R-10 根霉 Pectinase 黑曲霉
第五章 原生质体培养
一、原生质体的制备 基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化
原生质体活力测定
1、用于分离原生质体材料的准备
无菌试管苗叶片
培养细胞
2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或 胚性悬浮细胞
叶肉原生质体
原生质体分离常用的商品酶
酶
纤维素酶类 onozuka R–10 Cellulysin Driselase
Purified protoplasts
4、原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定
原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能
自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发 荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可 以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 。
建立细胞悬浮系
叶肉原生质体分离纯化
Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution with mannitol
Purification of protoplasts from leaf debris on sucrose gradient.
实验六植物原生质体的分离和培养
实验六植物原⽣质体的分离和培养实验六植物原⽣质体的分离和培养⼀．教学⽬标：了解植物原⽣质体作为细胞⼯程研究的重要意义，了解原⽣质体活性鉴定的原理。
掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。
掌握细胞活性的检测⽅法。
掌握细胞计数的原理和⽅法。
⼆．重点：掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。
掌握细胞活性的检测⽅法。
掌握细胞计数的原理和⽅法。
三．难点：分离和培养原⽣质体的技术。
四．授课⽅式与教学⽅法：讲解原理、实验操作⽰范或具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原⽣质体(protoplast)是除去细胞壁后为原⽣质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原⽣质体是⼀个常⽤的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因⽽使⽤纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原⽣质体。
由于原⽣质体内部与外界环境之间仅隔⼀层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原⽣质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常⽤⽢露醇或蔗糖，酶液还应含⼀定Ca2+来稳定原⽣质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原⽣质体的影响。
将原⽣质体接种在培养基上进⾏培养，细胞壁再⽣，细胞分裂和再⽣植株。
测定原⽣质体的活性有多种⽅法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染⾊是常⽤的⼀种⽅法,FAD 本⾝⽆荧光,⽆极性,可透过完整的原⽣质膜。
⼀旦进⼊原⽣质体后,由于受到酯酶分解⽽产⽣具有荧光的极性物质荧光素。
它不能⾃由出⼊原⽣质膜,因此有活⼒的细胞能产⽣荧光,⽆活⼒的原⽣质体不能分解FAD⽆荧光产⽣。
细胞计数⼀般⽤⾎细胞计数极，按⽩细胞计数法进⾏计数。
从理论上讲，植物体的任何⼀部分都可以通过酶解作⽤去除细胞壁⽽得到原⽣质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
所以，为了制备健康的原⽣质体，⼀般选⽤根尖、茎尖、嫩叶及对数⽣长期的愈伤组织为材料，⼀旦细胞具有⽊质化或次⽣加厚的外壁，则不能被酶降解。
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
[课件]植物原生质体的分离与纯化PPT
![[课件]植物原生质体的分离与纯化PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/d05060451ed9ad51f01df28f.png)
实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶解时酶液的组成及浓度如何确定 ③ 研究原生质体的意义是什么？
植物细胞工程理论5
第五章原生质体的培养教学目标(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方法。
一、原生质体培养的意义1、原生质体(protoplast)原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，是能存活的植物细胞的最小单位。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。
它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
2、原生质体研究进展植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。
直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。
1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。
1986年，Spangenberg .单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。
此外原生质体融合，体细胞杂交的技术得到广泛的应用。
据统计目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。
其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
3、原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生成植株，不论在进行细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组培实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。
五 植物原生质体的分离与纯化
实验五 植物原生质体的分离与纯化 2017.10.266. 实验结果与分析6.1实验结果图1.光学显微镜下菠菜原生质体观察（物镜×40倍） H ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：细胞壁Q ：梯细胞 W ：原生质体碎片结果描述：光学显微镜下，完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的绿色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，绿色；视野中还有一些绿色的原生质体碎片；被分离的细胞壁为透明的圆形；梯细胞为透明螺旋状，形似梯子。
原生质体纯度：完整原生质体/总原生质体=27/65=41.5％① ② ③ ④ HP Q H K W结果分析：光学显微镜下原生质体为颗粒状的绿色不均匀分布是由于光学显微镜下看到的是原生质体的叶绿体，所以为颗粒状分布，又因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深；因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。
由于在制作悬浮液或离心时会对原生质体造成冲击，所以会有一些原生质体破碎。
梯细胞最终发育为维管。
原生质体的纯度为41.5％，相对来说结果还算理想，因为去除细胞壁的原生质体较为脆弱，很容易受到破坏。
W ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：木质素Q ：原生质体碎片结果描述：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的红色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，红色；视野中还有一些红色的原生质体碎片和呈黄色的木质素。
结果分析：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为红色，主要是因为在荧光下叶绿体泛红光，主要通过观察叶绿体来辨别原生质体的具体形态。
因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深，又因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。
视野中呈透明黄色的为木质素，为细胞壁的成分。
植物的原生质体培养PPT课件
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
第五章 植物原生质体的分离与培养
第五章 植物原生质体的分离、培养与杂交
杨柏云
南昌大学生命科学与食品工程学院
精选2021版课件
值得注意的是，在考虑分离植物原生 质体时，既要采用容易获得原生质体的 植物材料，但更重要的是要选用易于再 生完整植株的细胞。
详见图2
精选2021版课件
10
精选2021版课件
11
四. 植物原生质体的分离和纯化
(一) 原生质体的分离 旱在1892年就有人用机械法分离原生质
体。直到1960年，英国的科金(Cocking) 首先采用酶解法分离原生质体，这一重 要发现开辟了细胞工程研究的许多领域， 作出了巨大的贡献。
精选2021版课件
21
精选2021版课件
22
精选2021版课件
23
五. 影响原生质体分离的几个因素
1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差 异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度 也不相同，如分离根尖细胞的原生质体 要有较多的果胶酶。
2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不 同而有变化。
3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢 钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的 稳定性。
精选2021版课件
19
精选2021版课件
20
(三) 原生质体的活力测定
用于培养和细胞工程操作的必须是健康 的有活力的原生质体。
方法有二：
一是凭借形态可识别原生质体的存活性。 二是采用特异的染色方法来确定，可用 0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能 着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯 (FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光， 无活力的不产生荧光。
植物原生质体培养的关键技术
植物原生质体培养的关键技术植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术，它可以用于植物的无性繁殖、基因工程以及育种等研究领域。
下面介绍一些关键的技术步骤和要点。
原生质体的分离和培养1. 原生质体分离：首先从植物中取得组织样本，如叶片、茎段或花器官等，并在无菌条件下进行处理。
通过切细组织样本，加入酶解液，进行酶解反应，最终获得原生质体。
2. 培养基准备：制备培养基，包括基础培养基和添加物质。
基础培养基提供必要的营养物质和能量，而添加物质则供给原生质体特殊的生长因子和激素。
培养基应在无菌条件下配制，用于培养原生质体。
3. 原生质体培养：将分离得到的原生质体放置在培养基上，以适当的温度和光照条件下培养。
培养过程中要定期观察和检查原生质体的生长状态，以及调整培养基的成分和浓度。
原生质体培养的关键因素1. 无菌技术：无菌条件下进行原生质体培养是确保培养过程成功的关键。
在分离、培养和观察过程中，都要保持严格的无菌操作，避免细菌或真菌的污染。
2. 营养物质和激素：培养基中必须提供适当的营养物质和激素，以满足原生质体的生长需求。
营养物质包括碳源、氮源、矿质盐等，而激素会促进细胞分裂和分化。
3. 光照和温度：适当的光照和温度条件对原生质体的生长和发育至关重要。
光照可以提供足够的能量，而温度则影响酶活性和代谢速率。
原生质体培养的应用1. 无性繁殖：通过原生质体培养，可以实现无性繁殖，快速繁殖大量相同的植株。
这对于育种和植物繁殖的研究非常有用。
2. 基因工程：原生质体培养可用于植物的基因工程研究，如基因表达、基因转导和功能验证等。
这为研究植物基因功能和遗传改良提供了有力手段。
3. 药物及次生代谢产物生产：某些植物的次生代谢产物对药物研发具有重要意义。
通过原生质体培养，可以大规模生产这些药物及代谢产物。
结论植物原生质体培养是一项技术复杂但应用广泛的植物组织培养技术。
通过合理控制培养条件和关注关键步骤，可以成功地进行原生质体培养，并应用于植物研究、育种和基因工程等领域。
第五章 原生质体培养
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶 和纤维素酶
过滤、离心
二、 原生质体纯化
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团 和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可 以继续培养。清除这些杂质的过程称为原生质 体纯化。 • 原生质体纯化方法有：沉降法、漂浮法和不连 续梯度离心法三种
1、 沉降法
• 这些材料不受外界环境的影响，试验重 复性好，产生的原生质体产量、活性和 稳定性等比较理想。
④ 花粉细胞
• 花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双 重优点，花粉具有群体数量大、一致性好 和取材方便等优点，是细胞工程中一种特 殊的试验体系。
2. 酶的种类、组合和酶解时间
• 不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁 结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的 种类、浓度、组合及酶解时间也不同。
一、 概念： • 原生质体的概念 • 原生质体培养的概念
原生质体（Protoplast）
• 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开 的那部分细胞物质。
• 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸 露细胞。
植物原生质体培养的概念
指将植物细胞游离成原生质 体，在适宜的培养条件下，依据 细胞的全能性使其再生细胞壁， 进行细胞的分裂分化，并发育成 完整植株的过程。
3.酶液渗透压
原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养 液中必须调整渗透压，维持细胞内外平衡，防止 细胞吸水涨破和脱水邹缩（破坏内部结构）。
糖醇系统
• 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
• 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定 地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。 而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓 度，故不常用。但有的植物分离原生质体又是 蔗糖的效果最好。
实验七 植物原生质体的分离和培养
实验七植物原生质体的分离和培养一、实验目的：了解植物原生质体分离的基本原理及其过程二、实验原理：植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是基于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，获得原生质体。
其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。
原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组成，以及原生质体收集方法有关。
酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。
游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。
三、实验用品1、器材：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅。
2、实验材料：菠菜叶片3、试剂：（1）、酶解液成分如下：纤维素酶(cellulase，Onozuka )2%；果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。
植物原生质体的分离与融合
植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验（供同学们学习参考）甘蓝与紫甘蓝原生质体的分离与融合植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。
如果用近缘种内或种间的原生质体融合、可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。
目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。
1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。
3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。
材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。
一般为5-7。
酶的活性还与pH值有关。
Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5～6。
不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。
对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。
5.温度：对酶解效率有影响和植物原生质体得活力都有影响。
酶：40-50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。
试剂的配制：1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO（0.2mol/L4，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。
《植物生物技术导论》
《植物生物技术导论》自学指导中国农业大学继续教育学院内容体系本课程内容主要涵盖植物细胞组织培养技术、植物分子标记技术以及植物基因克隆技术等核心知识。
重点介绍植物组织器官培养；茎尖分生组织培养；细胞培养；体细胞杂交；种质保存的方法、原理及应用；植物遗传转化的方法、原理及应用；植物分子标记技术以及植物基因克隆技术。
内容要点课程共分十个章节讲述，每章内容及要求如下：绪论讲授植物生物技术的一般概念、发展简史及在农业中的作用。
要求掌握基本概念。
第一章植物细胞组织培养的基本技术主要内容包括基本设备，培养基的主要成分及制备，外植体的种类、消毒及培养，培养条件，继代培养。
要求掌握培养基的制备，外植体的选择、消毒与培养及适宜培养条件的选择。
第二章植物组织器官培养主要内容包括植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素和人工种子的制备。
重点讲授器官分化及体细胞胚胎发生的影响因素及实验方法和人工种子制备的具体方法。
要求掌握植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素及人工种子的制备。
第三章花药、花粉培养主要内容包括花药培养和花粉培养基本概念、培养方法和培养意义。
要求掌握花药、花粉的培养方法。
第四章细胞培养主要内容包括植物细胞培养方法及植物细胞培养的应用。
要求掌握细胞培养的方法。
第五章原生质体的分离、培养和体细胞杂交主要内容包括原生质体的分离、培养技术及体细胞杂交方法。
要求掌握原生质体分离机体细胞杂交方法。
第六章植物遗传转化主要内容包括植物基因工程的基本原理，农杆菌介导法、基因枪法、电击法等常用的几种遗传转化方法。
要求掌握农杆菌介导法、基因枪法转化的基本原理及方法。
第七章种质离体保存主要内容包括种质离体保存的意义、原理及方法。
要求掌握冷冻保存、低温保存的方法及原理。
第八章植物基因克隆主要内容包括植物基因克隆的方法。
要求掌握常用的克隆基因的方法及步骤。
第九章DNA分子标记主要内容包括DNA分子标记的概念及分子标记的种类。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
八. 原生质体融合
（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定 1. 杂种细胞的选择方法 （1）培养基促进异核体生长的选择方法 （2）叶绿素缺失互补选择法 （3）机械分离，肉眼分辩法 （4）双突变系选择法 （5）荧光标记选择法
八. 原生质体融合
2. 体细胞杂种的鉴定
这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
（一）原生质体融合的方法 1. 无机盐诱导融合 用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年
Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并 首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠 的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对 原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以 目前很少有人采用。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成
提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传 递，能量的转换，物质的运输等基本现 象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时 又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、 叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1：
融合技术要点：
P1 P2
混合静止1min
P1 P2
加入PEG
选 择
培 养
高Ca2+高pH
加入培养基
融 合
洗 涤
电场下形成原生质体凝聚体
八. 原生质体融合
3. 电融合技术
就是使用电融合仪，其优点在于避免了
PEG、高钙离子，高pH强加于原生质体 的生理非常条件，同时融合的条件更加 数据化，更便于控制和相互比较。 交变电流的强弱、处理时间的长短、电 泳冲的大小等因素对融合的效果都有明 显的影响。
八. 原生质体融合
2. 聚二乙醇（PEG）与高pH的Ca2+相结
合的诱导融合法 （1）以常规的方法收集原生质体，将两 亲本的原生质体高密度等体积混合。 （2）滴3滴混合的原生质体悬浮液于载 玻片上，放置10分钟。 （3）加PEG 450µ L。PEG的制备方法： 1gPEG加入pH5.5的2ml的0.1mol/L的葡萄 糖、0.5mmol/LCaCl2的0.7mmol/LKH2PO4 溶液中，再放置10－20分钟。
六. 培养原生质体的几种方法
原生质体经分离和纯化后，需要进行活力测定
和计数。原生质体培养时有一种密度效应，一 般在每毫升培养液中应有10 个左右的原生质体 有利于培养。计数可用血球计数板进行。 常用的原生质体培养方法有以下几种：(详见图 5) 1.液体培养法：是把纯化后的原生质体悬浮于液 体培养基中的培养方法。又可分为液体浅层培 养法和液体悬滴法二种。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
植物原生质体是脱掉了细胞壁的、仅有 质膜包围、裸露的、活植物细胞。与完整 的植物细胞相比，它有下列主要特点： 1.游离的原生质体是真正的单细胞，在同一 时间内能得到大量的遗传上同质的原生质 体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传 学研究。 2.原生质体能超越性细胞的一些不亲和障碍， 为较远缘的植物细胞杂交提供了融合亲本。
性，而且必须弄清楚融合亲本的双方各 贡献了哪些遗传成分，因为在杂种细胞 发育成完整植株的过程中，往往有一方 的染色体更易消减掉。 （1）形态学鉴定 （2）细胞学鉴定 （3）DNA内切图谱分析
3.比较容易用酶解法分离。
根尖组织也是植物原生质体的重要来源，
它可由各种植物的种子萌发后取得。 花粉经特异酶处理也能得到原生质体， 在单倍体遗传育种中有特殊的用途。
三. 植物原生质体的材料来源
原生质体也可以从组织培养的材料中大
量获得。由于组织培养的严格条件，使 得材料的重复性好，实验材料可做到常 年供应。 值得注意的是，在考虑分离植物原生 质体时，既要采用容易获得原生质体的 植物材料，但更重要的是要选用易于再 生完整植株的细胞。
l能获得大量的原生质体； l条件温和，原生质体完整性好；
l原生质体纯净度高；
下面以叶片和悬浮培养的细胞为材料介
绍分离原生质体的一般步骤：(详见图3)
四. 植原生质体的分离和纯化
1.材料的准备与消毒：取充分展开的幼叶，用自 来水冲冼干净后，放入70%洒精中进行表面消 毒，再放入2%的次氯酸钠溶液中处理10分钟， 再用无菌水冲冼3-4次。悬浮培养的细胞一般是 用胚性细胞，这有利于原生质体的再生。 2.酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米 见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中 处理，在25-28摄氏度，黑暗条件下酶解3-4小 时。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3天 的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置 低速转床酶解8-12小时。 分离植物原生质体常用试剂见表1.
八. 原生质体融合
用此方法的 诱导频率可以高达10%--50%。并
无种属特性，几乎可以诱导任何原生质体之间 的融合。 其原理是PEG是一种略带负电的高分子化合物， 在原生质体的融合中起到一种桥的作用，可以 使原生质体凝聚，而钙离子的加入会在质膜与 PEG中间起到连接作用。在洗脱PEG过程中， 会导致质膜表面电荷重排。由于粘连的质膜大 面积紧密相连，这种电荷的重排会导致一个原 生质体的负性电荷部分与另一个原生质体的正 电荷部分相连而导致融合。
五. 影响原生质体分离的几个因素
4.酶液的pH值也直接影响分离的速度和
稳定性。pH值低则分离速度较快，而损 坏的较多；pH值高则分离速度较慢，而 完整性较好；故酶液的pH值一般为57左 右。 5.取材植株的生理状态也是重要的因素， 如采用悬浮培养的细胞一般用继代三天 的较为理想。 (详见表二)
三. 植物原生质体的材料来源
研究表明，几乎能从植物的所有部位 得到原生质体(详见图二)，其中以叶片为 多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下 面几个优点： 1.取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培， 也可在试管中培育无菌苗。 2.原生质体在生理和遗传特性上比较一致。
三. 植物原生质体的材料来源
五. 影响原生质体分离的几个因素
1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差
异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度 也不相同，如分离根尖细胞的原生质体 要有较多的果胶酶。 2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不 同而有变化。 3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢 钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的 稳定性。
八. 原生质体融合
(4) 加0.5ml高Ca2+、高pH溶液，间隔10分
钟再加一次。其组成是50mmol/LCaCl2 、 50mmol/L的甘氨酸钠，pH10.5。 (5) 加1ml原生质体培养基洗涤，洗涤5次， 每次间隔5分钟。 (6)最后加300--500µ L原生质体培养基， 以微滴形式培养。
四. 植物原生质体的分离和纯化
(二) 原生质体的纯化
植物材料经酶解后纯化原生质体的步骤
如下： 1.酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网 过滤，以除去未消化的碎片。 2.将含有原生质体的酶液收集到离心管中， 低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上 清液。
(二) 原生质体的纯化
3.在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。
详见图2
四. 植物原生质体的分离和纯化
(一) 原生质体的分离
旱在1892年就有人用机械法分离原生质
体。直到1960年，英国的科金(Cocking) 首先采用酶解法分离原生质体，这一重 要发现开辟了细胞工程研究的许多领域， 作出了巨大的贡献。
四. 植物原生质体的分离和纯化
酶解法有下面几个优点：
过下面几个不同的阶段： 1.细胞壁再生： 2.细胞分裂： 3.愈伤组织或胚状体的形成： 4.植株再生：有二条途径，一是从愈伤组 织诱导形态发生；二是诱导胚状体。
八. 原生质体融合
原生质体融合，也叫体细胞杂交，就是
使分离出来的不同亲本的原生质体之间 在人工控制的条件下，像性细胞受精作 用那样互相融合成一体。 受精作用是一种自发的融合，而原生质 体由于质膜表面带有负电荷，它们之间 通常是相互排斥的，所以自然融合频率 极低。所以要采用一定的方法加以诱导 以促进原生质体的融合。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
3.原生质体能有效地摄取多种外源颗粒，
如DNA，质粒、病毒、细菌和其它细胞 器，因此在植物遗传工程中有重要作用。 4.植物原生质体也和植物细胞一样，具有 该植物体的全部遗传信息，在合适的培 养条件下，它能象一粒种子那样发育成 与其亲本相似的新的植物，即具有遗传 全能性。
六. 培养原生质体的几种方法
2.固体平板法：它是把原生质体均匀地埋
入琼脂培养基中的培养方法。 3.双层培养法：是在琼脂培养基上部加入 一薄层液体原生质体培养液的培养方法。 4.琼脂糖包埋法：同固体平板法。 详见图5
六. 培养原生质体的几种方法
七. 植物原生质体的发育和植株再生
植物原生质体在培养过程中，一般要经
第五章 植物原生质体的分离、培养与杂交
杨柏云
南昌大学生命科学与食品工程学院
一.引言
在细胞工程中，植物原生质体不但 是植物细胞杂交良好的亲本，而且是 植物细胞遗传工程的理想受体，此外， 植物原生质体也是细胞生物学研究的 很有用的实验材料。植物原生质体的 分离和培养是达到这些目的的重要技 术基础，因此，掌握和运用这一技术 是十分重要的。
4.重复上述操作三次，使酶解液充分除去，
最后用原生质体培养液洗涤一次。 上述的离心纯化法可细分为：A．沉降法； B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法结合等 三种。(详见图4)
四. 植物原生质体的分离和纯化
(三) 原生质体的活力测定