健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析_闫学艳

江西农业大学学报2015，37（2）：302－307http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis DOI：10．13836/j．jjau．2015045

闫学艳，何后军，刘宝生，等．健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析［J］．江西农业大学学报，2015，37（2）：302－307．

健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析

闫学艳，何后军，刘宝生，李昆，张锦华*

（江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045）

摘要：探讨腹泻对仔猪肠道菌群变化的影响，以健康仔猪和腹泻仔猪新鲜粪便为研究对象，利用传统平板计数的方法和PCＲ-DGGE技术比较了不同日龄健康和腹泻仔猪肠道菌群数量差异和菌群结构变化。结果表明不同日龄的仔猪粪便样品中的细菌总数，乳酸杆菌数腹泻组较健康组均有下降，其中21日龄健康与腹泻仔猪的细菌总数差异极显著，乳酸杆菌数差异显著；DGGE指纹图谱聚类分析表明，与其它日龄组相比21日龄健康组与腹泻组样品肠道总细菌和乳酸杆菌菌群结构均相似度最低。说明仔猪发生腹泻引起的细菌数量变化与菌群结构复杂程度变化可能存在一定的相关性。

关键词：仔猪；腹泻；活菌计数；乳酸杆菌；PCＲ-DGGE；菌群多样性差异

中图分类号：S828．286．4文献标志码：A文章编号：1000－2286（2015）02－0302－06

Diversity Difference Analysis of Intestinal Microflora

between Healthy and Diarrheal Piglets

YAN Xue-yan，HE Hou-jun，LIU Bao-sheng，LI Kun，ZHANG Jin-hua*（College of Animal Science，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，China）

Abstract：In order to study the effects of diarrhea on piglet’s intestinal microflora，healthy and diarrheal piglets feces were used as the research objects，the total number of bacteria and lactobacillus were counted by the traditional culture method．The diversity of total bacteria and lactobacillus was compared between healthy and diarrheal piglets by the method of PCＲ-DGGE．Compared to healthy piglets，there was a decrease in the number of total bacteria and lactobacillus at the stadium of21days in pigfarm A of diarrheal piglets．And the difference was significant．From the analysis of DGGE cluster．The similarity of total bacteria and lactobacillus between healthy and diarrhea piglets at the stadium of21days was the lowest．This suggests that maybe there is a certain correlation between the changes of bacteria structure and bacteria number with piglets’diarrhea．

Key words：piglet；diarrhea；live bacteria counts；lactobacillus；PCＲ-DGGE；diversity of microflora

正常仔猪肠道微生物菌群是一个复杂的微生态系统。Kim等2011年研究表明哺乳动物胃肠道菌群总量约为1014个，由500 1000种细菌组成［1］。通过菌群相互作用，使胃肠道这个复杂的微生态系统处于一个相对平衡的状态。正常肠道菌群起着很重要的作用，如肠道的发育、营养消化与吸收、生物拮抗、免疫等作用。动物机体抵抗外界环境不利因素，防止机体造成伤害的第一道防线就是肠黏膜屏障，

收稿日期：2014-05-28修回日期：2014-08-03

基金项目：国家自然科学基金（31460651）、江西省自然科学基金（20122BAB204015）和江西省科技支撑计划项目（20142BBF60001）

作者简介：闫学艳（1984—），女，硕士生，主要从事预防兽医学研究，E-mail：yanxueyansuc@163．com；*通信作者：张锦华，副教授，博士，E-mail：zhjh_1122@163．com。

第2期闫学艳等：健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析若肠道黏膜中的微生物数量和结构发生剧烈变化，使机体内微生物结构失衡，机体将会出现腹泻反应。仔猪腹泻是由多种原因引起的腹泻症状的总称，给养猪业造成了巨大损失，目前己经成为世界性的研究课题。仔猪在受到外界环境影响时，如病原微生物、应激等，肠道菌群结构和数量等易发生改变，加之仔

猪的生理结构、肠黏膜形态结构和功能不健全，体质较差的仔猪就可能肠道菌群失调，发生腹泻［2］。仔

猪发生腹泻时，消化道固有菌群会发生改变，如乳酸杆菌、双歧杆菌数量会降低，大肠杆菌的数量增加，

肠球菌的数量无显著差异［3］。同时有研究表明不同日龄，断奶，以及饮食变化也影响仔猪肠道内菌群

结构变化［4］。本研究利用传统细菌平板计数的方法和PCＲ－DGGE 技术比较了健康和腹泻仔猪肠道菌群数量差异和菌群结构变化，初步探讨腹泻对仔猪肠道菌群变化的影响。

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材料方法1．1主要试剂、酶及引物

MＲS 肉汤、平板计数琼脂、TEMED 、溶菌酶、

Taq 酶、10ˑPCＲBuffer 、dNTPs 表1本研究所用引物序列Tab．1

List of DNA oligo nucleotides used in this study 引物

Primer

序列5'－3'Sequence 5'－3'参考文献Ｒeference U968－GC

CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC Nübel 等［5］，1996L1401

CGGTGTGTACAAGACCC Bact0027

GTTTGATCCTGGCTCAG Heilig 等［6］，2002Lab0677

CACCGCTACACATGGAG Uni0515－GC

CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGATCGTATTACCGCGGCTGGCA Lab0159GGAAACAGGTGCTAATACCG 依据王迪［7］的方法配制蛋白酶K 溶液，

3mol /L NaAc ，TE ，20%SDS 溶液，1%的琼脂糖凝胶，磷酸盐缓冲溶液，

V （苯酚）ʒV （氯仿）ʒV （异戊醇）=25ʒ24ʒ1，EDTA （0．5mol /L ，pH =8．0），50ˑTAE 储备液，40%丙烯酰胺贮存液，0%变性剂储存液，100%变性剂储存液，10%过硫酸铵，8ˑ固定液，1ˑ固定液，银染液，显影剂。

1．2样品采集

采集7、14、21、28、35日龄健康仔猪和腹泻仔猪新鲜粪便，每个样取两份，一份用于细菌计数，另一

份－20ħ保存，进行PCＲ－DGGE 总菌菌群多样性及乳酸杆菌菌群多样性分析。

1．3细菌计数

将采集的7、14、21、28、35日龄三份健康仔猪和三份腹泻仔猪新鲜样品，以灭菌的0．85%生理盐水进行

稀释，取4个连续的稀释度，每个稀释度混合物取100μL ，涂布平板计数琼脂平板进行细菌总数计数，涂布MＲS 平板，进行乳酸杆菌计数，每个稀释度设两个重复。涂布完毕，先正置10min ，然后倒置放入培养箱培

养，细菌总数37ħ，48h 计数，乳酸杆菌烛缸中37ħ，

24h 计数。计算出每克样品中的细菌数。1．4仔猪肠道总细菌及乳酸杆菌的PCＲ－DGGE 菌群多样性分析方法

将保存于－20ħ冰箱的粪便样品按日龄，健康，腹泻分类，某日龄健康的和腹泻的粪便样品至少分别提取3份样品的DNA ，并用核酸微量浓度测定仪对提取的DNA 进行浓度测定，并保存于－20ħ冰箱。

1．5PCＲ扩增与样品DGGE

1．5．1肠道总细菌的16S rDNA 片段PCＲ扩增用带有GC 夹子序列的细菌通用引物（U968-GC 和L1401）对细菌总基因组DNA 的16S rDNA V6-V8区进行PCＲ扩增。PCＲ体系（25μL ）为ddH 2O 17．25μL ，

10ˑPCＲBuffer 2．5μL ，dNTPs 1．0μL ，上游引物1．0μL ，

下游引物1．0μL ，rTaq DNA 聚合酶0．25μL ，模板DNA 2．0μL ，空白对照不加模板，加2．0μL ddH 2O 。PCＲ反应程序为94ħ预变性5min ，

94ħ变性30s ，56ħ退火20s ，68ħ延伸40s ，35个循环，最后68ħ延伸7min 。1%琼脂糖凝胶电泳对PCＲ产物进行检测。

1．5．2乳酸杆菌的16S rDNA 片段套式PCＲ扩增用第一对引物（Bact0027和Lab0677）PCＲ扩增出16S rDNA700bp 左右的片段。PCＲ体系同肠道总细菌的16S rDNA 片段PCＲ扩增，PCＲ反应程序为

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