可注射水凝胶的研究进展

可注射水凝胶的研究进展
一、水凝胶定义
水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有交联网络结构的聚合物，在聚合物网络结构中含有亲水基团或亲水的链段，它们在水环境中能够与水结合，从而形成水凝胶结构，这种水凝胶结构使得亲水的小分子能够在其中进行扩散。

原位可注射水凝胶是近年来出现的新型水凝胶体系。

通过注射的方法将具有一定流动性的生物材料植入体内，因此很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，手术创伤非常微小。

该体系可由酸碱度、温度的变化或者多价离子的存在而产生溶液-凝胶相转变，或通过共价键而形成水凝胶。

二、水凝胶分类
根据水凝胶对外界刺激的应答情况，可以分为两类化合物：一类是传统的水凝胶高分子材料，这类水凝胶对环境的变化相对不是很敏感；而另外一类则是对外界条件非常敏感的水凝胶高分子材料，这类水凝胶高分子材料由于对于不同的环境条件具有不同的应答表现，因此可以作为一种新型的智能材料来使用，具有良好的科研和市场应用前景。

智能型水凝胶是一种可以进行传感、处理并且具有执行功能的高分子材料，作为一种新型的智能材料，在诸多领域有着重要的用途。

根据对外界环境条件的刺激表现出不同的响应情况可以分为：温度敏感性的水凝胶高分子材料、对于pH敏感性的水凝胶高分子材料、对光敏感的水凝胶高分子材料、对压力敏感的水凝胶高分子材料、对于生物分子敏感的水凝胶高分子材料、对于电场敏感的水凝胶高分子材料等。

1、温度敏感性水凝胶
这一类水凝胶高分子材料的溶胀与收缩性，对于温度的变化具有非常高的敏感度，具体表现为在较低温度下溶胀度较高，在相对较高温度下溶胀度比较低。

该凝胶具有最低临界共溶温度（LCST），即溶胀度的变化和温度的变化并不是线性的，在某一温度下水凝胶的体积表现为突然的收缩和膨胀。

2、pH敏感性水凝胶
水凝胶高分子材料对于pH的敏感性是指其溶胀或消溶胀作用是随着pH值的不同而进行变化。

具有pH响应性的水凝胶都是通过交联而形成大分子网络，网络中含有酸性或碱性基团，随着介质pH值、离子强度改变，这些基团发生电离，导致网络内大分子链段间氢键的解离，引起不连续的溶胀体积变化。

3、光敏感性水凝胶
水凝胶高分子材料的光敏感性是指水凝胶在受到光照的刺激下而发生的一种体积相互转变的现象。

除此之外还有磁性水凝胶、压力敏感性凝胶以及聚合物水凝胶等。

三、制备水凝胶的材料
凡是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，都可以形成水凝胶。

理想的材料都应具备以下条件：①良好的生物相容性。

②适当的生物降解性。

③具有三维立体多孔结构，孔隙率最好达90%以上，且有很高的面积体积比。

④具有可塑性和较好的力学强度。

⑤材料表面微环境利于细胞黏附、增殖，能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。

常用材料根据来源不同可分为天然材料、合成材料和复合材料。

1、天然材料
天然材料往往是生物衍生的聚合物，一般生物相容性良好。

天然高分子材料有淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、胶原、弹性蛋白、透明质酸盐、纤维素、海藻酸盐、葡聚糖、琼脂糖和明胶等。

但天然材料的质量会因产地及来源的不同而有所差异，存在着天然产品在批次之间性能和质量的重现性波动很大的缺陷。

（1）纤维素衍生物（Cellulose derivatives）
低浓度（1~10wt%）下，纤维素衍生物水溶液可在加热后形成凝胶。

甲基纤维素在40~50℃间时可形成不透明凝胶。

羟丙基甲基纤维素（HPMC）则在75~90℃时发生相转变。

他们的相转变温度可通过物理或化学改性来降低。

比如，NaCl的加入可以使甲基纤维素的相转变温度降低至32~34℃。

同样，通过降低HPMC的羟丙基取代度，可以使它的转变温度降低到大约40℃。

（2）木葡聚糖（Xyloglucan）
木葡聚糖在特定条件下溶于水后可形成温敏型凝胶。

它主要由（1，4）-β-D-葡聚糖主链构成，支链为（1，6）-α-D-木糖，部分为（1，2）-β-D-乳糖所取代。

当木葡聚糖被β-半乳糖苷酶部分水解后，终产物在水溶液中可发生热可逆凝胶化，而天然木葡聚糖则不会出现这种现象。

只有当半乳糖移除率达到35%以上时才会发生凝胶化。

转变温度与聚合物分子浓度及半乳糖移除率成反相关。

（3）壳聚糖（Chitosan）
壳聚糖的化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，在一般情况下，壳聚糖只溶于酸性溶液中，但是壳聚糖溶液中加入含羟基聚合物、碱性盐或是对壳聚糖为母体进行加成反应、衍生化和接枝反应，可得到具有温度敏感型或pH 敏感型的壳聚糖基物理水凝胶；其中温敏型水凝胶表现的特点是在生理pH（7.4）及室温下保持溶液状态，而在温度升到37℃时体温固化，原位形成凝胶。

壳聚糖具有良好的生物相容性、微生物可降解性和促进伤口愈合的功效，广泛应用于生物医用领域。

壳聚糖作为生物材料在细胞培养方面可以增加细胞的粘附性，当植入体内后可以促进分子聚集在移植物内。

由于壳聚糖的机械性能比较差，常常与其他材料复合才可以达到预期的目的。

2、合成材料
合成材料大部分为生物可降解型合成高分子材料，包括丙烯酸及其衍生物类（聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚N-聚代丙烯酰胺等）、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及它们的共聚物PLGA、聚己内酯(PCL)、聚羟基烷基酸酯(PHA)、聚酸酐、聚磷睛等。

合成材料可根据需求来进行分子设计，且性能的重现性好，可批量生产。

但同天然材料相比，其生物相容性较差。

聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶，是一种典型的温度敏感性水凝胶，其低临界溶解温度（LCST）约在32℃，LCST可通过与其他单分子的共聚作用来调节。

这一高分子体系中存在两种氢键: 水分子与高分子链之间的氢键和高分子链之间的氢键。

当外界温度低于LCST 时, 两种氢键的相互协调作用使得疏水基团周围形成一个稳定的束缚水分子的水合结构。

随着温度升高, 水合结构破坏, 疏水作用占主导, 使凝胶中的束缚水变成自由水分子并向外扩散, 凝胶发生相分离, 内部结构塌陷, 体积剧烈收缩, 即水凝胶的温敏性相转变是由交联网络的亲/疏
水性平衡受外界变化而引起的。

3、复合材料
各种天然材料、合成高分子材料、生物衍生材料既可单独用作支架材料，也可相互搭配或组合形成大量性质各异的复合材料。

复合材料可以很好地避开单一材料的缺点，实现优势互补。

材料的生物活性取决于材料的组分。

水凝胶材料科学的组合、合适的成分对种子细胞的粘附、生长、分化及自身的活性等都极为关键。

四、水凝胶的形成机理
水凝胶的形成主要有物理交联和化学交联两种主要途径。

物理交联型水凝胶是指由于分子缠结和离子、氢键、疏水相互作用的存在而形成的网络结构。

大致可分为离子交联型和温度响应型两种。

形成物理交联水凝胶的条件之一就是体系中物理交联点的形成。

物理交联点的形成可以通过多种方式，如离子间的相互作用、疏水相互作用、结晶及氢键作用等。

化学交联型水凝胶是运用传统合成的方法或光聚合、辐射聚合等技术，引发共聚或缩聚反应产生共价键而形成的共价交联网络。

化学交联水凝胶结构比较稳定，强度较高，反应可控制性较好，易于操作，但由于需其它物质参与，并伴有化学反应，因此会对细胞的影响较大。

五、水凝胶的检测参数
在选择或合成适当的水凝胶支架材料时，应综合考虑物理性能、传质性能和生物相互作用，这些性能或设计参数由支架的用途和植入部位的环境来决定。

实验中测定的参数有：
（1）傅里叶红外光谱法(FTIR)
采用红外光谱仪，用KBr压片技术分析原料及合成材料的主要特征官能团及化学键的变化和相互作用。

（2）内部结构测定
采用扫描电镜观察水凝胶内部网络状结构的分布等结构特征。

（3）孔隙率和孔径的测定
采用溶液替代法计算不同水凝胶的孔隙率。

选用体积为10mL的离心管，装满乙醇。

首先测量水凝胶的体积和干重，然后将干样放于盛有等体积乙醇的离心管中，一定时间后取出水凝胶样品称重，计算水凝胶的孔隙率。

从水凝胶扫描电镜图中选择尽量不同的孔径，采用平均值的方法计算该水凝胶的表面孔径。

（4）机械强度的测定
采用电子万能材料试验机来测量水凝胶的压缩载荷和弹性模量。

首先将溶胶放于10mL的离心管中在37℃条件下制备成一定直径一定长度的圆柱状水凝胶进行抗压试验。

（5）凝胶时间的测定
采用试管倒置的方法检测凝胶时间。

将配好的溶胶离心管中，放于恒温金属浴或水浴锅中，使用秒表计时，凝胶时间为溶胶在离心管中流动至离心管倒置后不流动之间的时间。

在不同的温度梯度范围内检测该水凝胶的形成时间。

（6）细胞毒性实验
MTT比色法实验是评价水凝胶体系中的浸提液有无潜在的细胞毒性。

MTT 商品名是噻唑蓝。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞相对存活率的方法。

用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定外源性MTT被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原后的甲瓒，其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒。

WST-8产生的甲瓒易溶解，且WST-8化学性质更稳定，因此实验结果相对更加稳定。

此外，WST-8相比于MTT线性范围较宽，灵敏度更高。

当细胞增殖越多、越快，则甲瓒产生量越多，颜色越深；反之，当内外因造成的细胞毒性越大，则颜色越浅。

对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖（活性）相关数据。

（7）体外降解实验
配制50%的I型胶原酶和0.25%胰蛋白酶液，干燥后的水凝胶材料称重紫外照射，在无菌操作条件下分别置于相同体积的酶液中，放于37℃细胞培养箱中，定期取样，真空冷冻干燥机干燥后称重。

（8）体内组织相容性实验
水凝胶材料的制备必须在无菌操作条件下，而且每种原材料必须是无菌的。

因此将制备好的材料用1mL的注射器注射入小鼠皮下，定期取样用中性甲醛固定。

①H&E染色
将固定好的组织材料经过组织脱水后包埋、切片、H&E染色等一系列的处理，然后置于光学显微镜下进行组织学观察。

②免疫组化
免疫组化是应用免疫学基本原理即抗原抗体的反应（抗原与抗体特异性结合的原理），通过化学反应来使标记抗体的显色剂（酶、荧光素、同位素、金属离子）显色来确定组织细胞内抗原（蛋白质和多肽），并对抗原进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

通过免疫组化实验可以对组织进行一个更精确的形态学判断。