12 生物化学实验--核酸的定量分析

核酸的定量分析
【目的】
1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。

2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。

【原理】
核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。

1 ．定糖法
通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。

RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。

核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。

DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。

2 ．定磷法
通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。

核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。

用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。

当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。

本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。

3 ．紫外吸收法
核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。

核酸在 260nm 的吸光度值与其浓度在一定范围内成正比关系，这是进行定
量分析的依据。

为了消除样品中核酸以外的小分子物质和核苷、核苷酸或低聚多核苷酸的影响，测定时需加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂，沉淀除去核酸，测定上清液 260nm 处吸光度值作为对照。

将样品的吸光度值减去上清液的吸光度值即为样品核酸的吸光度值。

在 260nm 波长下， 1μg/ml 的 DNA 溶液的吸光度为0.020 ， 1μg/ml 的 RNA 溶液的吸光度为 0.022 ，以此为标准，根据所测得样品的吸光度值即可计算出溶液中核酸的含量。

【器材】
1 ．试管和吸量管
2 ．微量移液器
3 ．电炉和烧杯
4. 分光光度计
5 ．离心机和离心管
【试剂】
1 ． 5mol/L 硫酸
2 ．过氧化氢
3 ． RNA 标准液（ 40μｇ /ml ）
称 RNA40mg ，加 0.1mol/L NaOH 数滴使其溶解，加水到 1 000ml 。

4 ． DNA 标准液（ 400μｇ /ml ）
称 DNA40mg ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。

5 ． 3,5- 二羟甲苯试剂
预先将 3,5- 二羟甲苯在笨中重结晶 1 ～ 2 次，用活性炭脱色，干燥后备用。

取 3,5- 二羟甲苯 0.1g ，加浓盐酸 100ml 使溶解，再加入二水合氯化铜（ CuCl 2 ·2H 2 O ） 0.15g 使溶解，混合即可。

6 ．二苯胺试剂
取用 70% 乙醇重结晶的二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰醋酸中，然后再加浓硫酸（保证试剂） 2.75ml 混匀。

此二苯胺试剂见光变绿色，需临用前配制，贮于棕色瓶放入冰箱内保存。

7 ．微量定磷试剂
6mol/L 磷酸：蒸馏水： 2.5% 钼酸铵： 10% 抗坏血酸 1 ： 2 ： 1 ： 1 （ V/V ）。

此试剂当天配制，应为黄色或浅绿色，如果呈棕色或深黄色则不能使用。

8 ．标准无机磷溶液
用110 ℃ 恒重的 KH 2 PO 4 配制 100μｇ磷 /ml 的贮存液，使用前稀释成10μｇ磷 /ml 。

9 ．过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂
70% 过氯酸 14ml ，加钼酸铵 1.0g ，加水 386ml 。

10 ．核酸样品液（ 10mg/ml ）
称粗制核酸样品 1g ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。

或者，取本教材实验十从动物组织中提取出的核酸样品作为本次实验的样品液。

【操作】
1 ．定糖法
（ 1 ） RNA 的定量：取三支试管，标号，按下表操作。

将各管混匀，放入沸水浴中加热 25min ，冷却后于 670nm 测定其吸光度值。

样品液中 RNA 含量的计算公式如下：
样品液中 RNA 含量（μｇ /ml ）＝
（ 2 ） DNA 的定量：取三支试管，标号，按下表操作。

将各管混匀，放入沸水浴中加热 15min ，冷却后于 595nm 测定其吸光度值。

样品液中 DNA 含量的计算公式如下：
样品液中 DNA 含量（μｇ /ml ）＝
2 ．定磷法
（ 1 ）总磷测定
① 消化：取样品 1ml （ 0.2 ～ 10mg 核酸）注入微量凯氏烧瓶中，加 5mol/L 硫酸 2.5ml, 加热到发白烟，溶液变为棕黄色时，放下冷至室温，加入过氧化氢0.1ml （约 2 滴），继续加热至溶液透明为止。

冷却至室温，用蒸馏水稀释至50ml 。

② 显色：取试管三支，标号，其中两支各加入消化液 3ml ，另一支加入蒸馏水3ml 作空白，然后加入定磷试剂 3ml ，摇匀，于 45 C 水浴中保温 25min 。

③ 比色：用上述显色液在 660nm 处测定吸光度。

（ 2 ）无机磷的测定：取样品 3ml ，加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 3ml ，摇匀，放置 30min ，离心，取上清液，用上述同样的方法进行显色和比色。

（ 3 ）无机磷标准曲线的绘制：取 6 支试管，标号，按下表操作：
混匀各管试剂，在 660nm 波长下测定吸光度值，以各管含磷量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出标准曲线。

（ 4 ）计算：根据总磷和无机磷的吸光度值，由标准曲线即可查出样品中总磷量和无机磷量，然后可根据下式计算出样品中核酸含量。

总磷量等于由吸光度值在标准曲线上查得的磷微 g 数乘以 50/3 ，无机磷量等于由吸光度值查得的磷微 g 数除以 3 。

样品液中核酸含量的计算公式如下：
样品液中有机磷含量（μg /ml ）＝总磷量－无机磷量
样品液中核酸含量（μg/ml ）＝有机磷含量×11.45
式中， 11.45 为换算系数，表示 1μg 磷相当于 11.45μg 核酸。

3 ．紫外吸收法
（ 1 ）原液的制备：取样品液 1ml ，稀释至 100ml ，此为原液。

（ 2 ） A 液的制备：取原液 2ml ，再稀释至 50ml ，此为 A 液。

（ 3 ） B 液的制备：另取原液 4ml ，加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 1ml ，摇匀后置冰箱中 20 分钟，离心 10 分钟， 3 000r/min ，取上清液， 2.5ml 稀释至 50ml ，此为 B 液。

（ 4 ）比色：将 A 液和 B 液分别于 260nm 波长处比色测定其吸光度 a 和 b 。

a －
b 即为样品核酸的吸光度。

（ 5 ）计算：样品液中核酸含量的计算公式如下：
DNA 含量（μg/ml ）＝
RNA 含量（μg% ）＝
式中， 0.020 表示 1μg /ml 的 DNA 溶液测定的吸光度值； 0.022 表示 1μg /ml 的 RNA 溶液测定的吸光度值； 2500 为稀释倍数。

【注意事项】
1 ．市售商品 RNA 及 DNA 不纯，因此欲配制标准液之前，需用定磷法求出其中磷含量，以推算出实际含量。

2 ．蛋白质对 RNA 和 DNA 的测定均有干扰，因此，在样品蛋白质含量高时，应预先用 5% 三氯醋酸将蛋白质除去，制备成无蛋白质滤液后再测定。

3 ．以定糖法定量时，① 应尽量避免其它糖类及其衍生物和醛类化合物对定糖测定的干扰。

② DNA 对 RNA 的测定有干扰，在用 Cu 2+ 作催化剂时，同时有减少 DNA 干扰的作用，改良地衣酚法即用 CuCl 2 作催化剂。

4 ．以定磷法定量时，① 核酸样品应彻底消化，是有机磷完全转化为无机磷。

消化不彻底可以使结果偏低。

② 溶液中的维生素 C 已被空气中的氧氧化，应储存于冰箱中，使用前应检查是否失效。

③ 定磷试剂应当日配制。

5 ．以紫外吸收法定量时，① 样品溶液加入沉淀剂沉淀核酸时，应在冰浴中保持，以避免核酸的降解，因为核酸降解后有增色效应。

② 要用石英比色杯，石英比色杯可以透过紫外线。

【思考题】
1 ．定糖法测定 RNA 和 DNA 含量的实验原理有哪些异同？用 CuCl
2 作催化剂比用 FeCl
3 催化剂有哪些优点？
2 ．定磷法测定 RNA 和 DNA 含量时，核酸在消化过程中发生了哪些化学变化？定磷试剂的主要成分有哪些？它们的作用是什么？
3 ．紫外吸收法测定 RNA 和 DNA 含量时，为什么要用石英比色杯？核酸溶液能吸收紫外光的原因是什么？。