实验六 紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应

实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应、抗菌素生物效价的评价及裂解性噬菌体效价测定

（-----结果分析）

•实验目的与要求：

•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。

•2、学会裂解性噬菌体效价测定方法。

•3、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。

一、紫外诱变枯草芽胞杆菌效应

• 1.紫外诱变过程：

•紫外线诱变采用15W紫外线杀菌灯；在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热；灯与处理物的距离为30cm；无菌取菌悬液使其厚度为0.5～1.0cm，放在紫外灯的照射台上，开启电磁搅拌器开关。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

•照射时间：未照射前（0时），照射1min，照射2min，照射3min时分别取样0.5ml；

每照射到时间马上无菌取样，加到已经编号的第1个试管，为10-1，共有4个时间的10-1 ，分别将其稀释至：

•0min 1min 2min 3min

•稀释度10-610-710-8 10-610-710-8 10-510-610-7 10-410-510-6

•每个稀释度各取0.2ml涂平板，共涂12块平板，做好标记，37℃培养48hr。

• 2.计算致死率

•（1）对照样品中活菌数：将培养至48h后对照古板取出进行细胞计数，根据平板上菌勤务员落数，计算出对照样品1ml菌液中的活菌数。同样方法数出紫外线处理1、

2、3min后的细菌数。

•（2）致死率计算：

（3）画出致死率曲线：横坐标为照射时间，纵坐标为致死率。

• 3.观察诱变效应

•在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

•分别测量透明圈菌落计算比值（HC值），与对照平板进行比较。

二、抗菌素滤纸片法测定生物效价

• 1.实验操作过程：

•（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。

•（2）青霉素的稀释：青霉素按10倍稀释法稀释至1U/ml。将直径5mm的圆形滤纸片，分别蘸取1、10、100 u/ml的青霉素溶液。在管壁贴至无液体流出时，放置在上述培养的表面上，轻压固定，每个浓度贴在一个平板上。然后将培养皿放入37℃的培养箱中，培养16-18小时，测定抑菌圈的直径。

• 2.实验结果

•测定不同青霉素滤纸片周围抑菌圈直径

三、噬菌体效价的测定

• 1.实验操作过程：

•制备底层平板：平皿中先倒入肉膏蛋白胨固体培养基。

•取0.5ml噬菌体浓缩液，加到4.5ml/管的1％蛋白胨水进行10倍系列稀释，依次稀释至10-7稀释度。

•分别吸取最后三个稀释度的噬菌体稀释液0.1ml，和0.2ml敏感菌菌液直接加入到底层培养基上。

•立即将45-50℃保温的5ml上层半固体培养基倒入到底层培养基中混合均匀，使上层培养基均匀地铺满整个底层平板。

2.噬菌体效价：是指1ml培养液中含侵染性的噬菌体粒子数。

（1）噬菌斑计数：

（2）.噬菌体效价计算：以每皿出现30-300噬菌斑的平板计算噬菌体效价。

本次实验总结：

1.稀释

（1）枯草芽胞杆菌诱变前：稀释至10-8，生理盐水

（2）枯草芽胞杆菌照射1min取稀释至10-8 ，生理盐水

（3）枯草芽胞杆菌照射2min取稀释至10-7 ，生理盐水

（4）枯草芽胞杆菌照射3min取稀释至10-6 ，生理盐水

（5）青霉素称取0.01克稀释至1U/l ，生理盐水

（6）噬菌体噬菌体稀释至10-9 ，蛋白胨水

2.平皿

（1）进行枯草芽胞杆菌诱变3个时间和未诱变菌，取后三个稀释度，共接12个平皿。（2）青霉素稀释至1、10、100U/ml，加入到3个平皿中。

（3）噬菌体稀释至10-9，取后三个稀释度，每个二次重复，二个对照，共8个平皿。本次实验共接种23个平皿。

实验报告内容：

•记录紫外线诱变育种枯草芽胞杆菌及接种过程。

•记录青霉素效价评价操作过程。

•记录噬菌体效价评价操作过程。

1、记录双层平板上的噬菌斑数目，计算噬菌体效价

注:噬菌体校价=pfu数×稀释倍数×10