肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用随着科学技术的不断进步，干细胞技术已开始被应用于临床治疗中，尤其是在肿瘤治疗中。
干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新和分化成多种细胞类型的潜能，因此被广泛研究并用于临床治疗。
本文将介绍干细胞技术在肿瘤治疗中的应用，包括干细胞移植、干细胞免疫治疗和干细胞治疗耐药性肿瘤等方面。
一、干细胞移植在干细胞移植中，一种或多种类型的未分化干细胞被通过手术移植到患者的体内，以代替已经损坏或死亡的细胞并恢复组织的功能。
这是一种广泛应用于肿瘤治疗中的治疗方法，可用于恢复因癌症治疗而导致的非造血细胞的缺陷和免疫系统的功能，通过提高治疗的效果和减少治疗后的不良反应，以改善患者的生存率和生存质量。
在干细胞移植中，研究人员通常使用的干细胞类型是造血干细胞和淋巴细胞。
造血干细胞可以分化成一个或多个血细胞系列的血细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。
淋巴细胞则是免疫系统的主要细胞组成部分，可以分化成效应细胞和记忆细胞，以激发和保持免疫反应。
二、干细胞免疫治疗干细胞免疫治疗是应用干细胞的一种新型治疗方法，旨在改善免疫系统对肿瘤的反应。
在干细胞免疫治疗中，研究人员通常使用的干细胞类型是免疫干细胞和肿瘤干细胞。
免疫干细胞可以从患者或捐赠者体内获取，并在实验室中培养和扩增。
此后，这些免疫干细胞可以重新注入到患者体内，以增加免疫系统对肿瘤的反应。
肿瘤干细胞则是从患者或捐赠者体内获取的未分化细胞，这些细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，可以通过适当的刺激和诱导分化成免疫干细胞。
在肿瘤干细胞分化后，它们可以被使用在干细胞免疫治疗中，以增强免疫系统的对肿瘤的反应。
三、干细胞治疗耐药性肿瘤肿瘤的耐药性是指肿瘤细胞在作用于其上的化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段后不再受治疗影响，导致治疗的难度加大。
干细胞的优势在于它们可以定向分化成给定细胞类型，并因此用于治疗耐药性肿瘤。
研究人员利用干细胞为药物输送增加了非常有前途的传递方式，如包括导向药物输送、控制释放、检测和修复损伤组织等。
那些肿瘤干细胞的研究套路-序章与实验方法介绍
那些肿瘤⼲细胞的研究套路-序章与实验⽅法介绍近年来，肿瘤⼲细胞（Cancer stem cells，CSCs）逐渐成为肿瘤研究中的热点，2014年以来发表在⾼影响因⼦的各领域顶级期刊上的⽂章超过了数百篇。
再来看看2018年的国⾃然基⾦项⽬，肿瘤⼲细胞的项⽬也有37项之多，不管肿瘤⼲细胞的概念过去存在多少争议，越来越多的SCI⽂章都在发表肿瘤⼲细胞相关的研究，本系列将以⼏个篇幅详细介绍⼀下肿瘤⼲细胞的基本概念、研究思路、实验⽅法和论⽂套路。
序章肿瘤⼲细胞是指⼀类具有⼲细胞的特征，包括休眠、DNA修复机制激活、ABC药物转运蛋⽩⾼表达、以及对细胞凋亡的天然抗性的⼀群特殊的肿瘤细胞。
这群特殊的肿瘤细胞还具有以下⼏个特征，第⼀是⾃我更新能⼒，即可以产⽣与亲代完全相同的⼦代细胞；第⼆是分化潜能，即可以分化成不同亚群的肿瘤细胞；第三是⾼成瘤性，即很少量的肿瘤⼲细胞就⾜以在体内起始肿瘤发⽣。
研究表明肿瘤⼲细胞在肿瘤的发⽣起始，转移以及耐药的过程中发挥着重要作⽤，下⾯着重介绍⼀下肿瘤⼲细胞的实验⽅法和⼤体研究思路。
1) 肿瘤⼲细胞分离⽬前主要采⽤FACS（流式细胞分选术）和MACS（磁珠分选）技术，FACS能够通过肿瘤⼲细胞表⾯特殊表⾯标志物的表达（如CD133，CD24，CD44等）进⾏肿瘤⼲细胞的分离，MACS则⼀般利⽤CD133作阳性选择分离细胞。
（附表1：不同肿瘤⼲细胞表⾯标志物）表1 不同肿瘤细胞表⾯标志物2) 肿瘤⼲细胞体外培养采⽤肿瘤⼲细胞微球Oncosphere体系对常规肿瘤细胞系或者病⼈来源的肿瘤⼲细胞进⾏培养： Oncosphere即⼲细胞成球，通过⽆⾎清的⼲细胞培养基在低吸附的培养板上对肿瘤细胞进⾏培养可以得到悬浮的球状细胞团（图1），细胞处于⽆⾎清培养基及超低黏附培养板中，在这种培养条件下，分化的肿瘤细胞渐渐死亡，肿瘤⼲细胞则会存活并增殖形成细胞微球。
图1 肿瘤⼲细胞sphere培养体系观察以乳腺癌与结肠癌为例，Oncosphere培养体系如下：乳腺癌CSC培养体系结直肠癌CSC培养体系DMEM/F-12DMEM/F-12B27 1X B27 1X20ng/ml EGF20ng/ml EGF20ng/ml bFGF20ng/ml bFGF0.4% BSA Penicillin/Streptomycin5ug/ml InsulinPenicillin/Streptomycin3) 肿瘤⼲细胞的鉴定和⼲细胞特性检测除了前述提到的染⾊肿瘤⼲细胞特异性表⾯marker并通过流式细胞术鉴定CSC外，成球能⼒也是肿瘤⼲细胞体外鉴定和反应⼲细胞特性的重要指标。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
肿瘤干细胞名词解释
肿瘤干细胞名词解释肿瘤干细胞是一种特殊类型的细胞，可以通过不同方式来发展成其它类型的细胞，从而为肿瘤细胞提供利用或被肿瘤细胞所利用的能力。
其广泛应用于肿瘤研究，为肿瘤研究和治疗提供了新的方法。
肿瘤干细胞是细胞培养技术的重要组成部分，广泛用于生物医学研究的各个领域，如癌症研究、细胞生物学和细胞分子生物学等，已成为肿瘤研究的一个主要部分。
肿瘤干细胞具有多重特性，基本上可以被归纳为三类：肿瘤母细胞、肿瘤前体细胞和肿瘤细胞。
肿瘤母细胞是指能够自动复制的细胞，可被肿瘤细胞长期利用的细胞。
它们有着复杂的分子和结构特征，通常具有自我重组和自我复制的能力，比肿瘤细胞更加强大。
比起肿瘤细胞，肿瘤母细胞更加稳定。
它们可以被肿瘤细胞长期利用，作为攻击身体细胞的“坦克”而被肿瘤细胞利用。
肿瘤前体细胞是指生成肿瘤细胞的细胞，是肿瘤发展的最初状态。
肿瘤前体细胞具有两个重要特征：一是非常脆弱，易受损害，可以被抗癌药物破坏；二是它们具有某种能力，可以与其它细胞融合，形成新的细胞，肿瘤细胞也是其中一种。
肿瘤细胞是最重要的肿瘤细胞，是肿瘤的核心，它们可以通过一系列的过程来复制自身，并向周围组织繁殖，最终形成肿瘤组织。
具有特殊的生物学特性，如具有强大的抗药性和耐受性，很难被抗癌药物抑制。
肿瘤干细胞在肿瘤研究中有着重要的作用，可以对肿瘤细胞的功能和生长进行有效控制。
在诊断阶段，它们可以帮助评估患者的疾病状态和治疗效果；在治疗阶段，它们可以用于新型抗肿瘤治疗的开发，为肿瘤的治疗提供有力的支持。
总之，肿瘤干细胞是肿瘤研究的重要组成部分，具有自我复制能力和肿瘤细胞长期利用的特性，可以用于诊断和治疗肿瘤，成为新型抗肿瘤疗法研究的有力支持。
肿瘤干细胞的研究和应用，有助于我们更好地理解肿瘤病理生物学，更有效地治疗肿瘤。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
肿瘤再生医学的新方法和新技术
肿瘤再生医学的新方法和新技术随着科技的迅猛发展和医疗技术的不断进步，肿瘤的诊疗也在不断地被改善和更新。
肿瘤再生医学是一种新兴的治疗方法，它采用干细胞、基因技术、蛋白质工程、再生医学、生物制备和干细胞疗法等技术手段，旨在通过修复、替代或再生受损组织，达到治疗肿瘤的目的。
本文将介绍肿瘤再生医学的新方法和新技术。
一、肿瘤干细胞治疗技术肿瘤干细胞是一种能够自我更新和产生多种不同类型肿瘤细胞的细胞种类。
肿瘤干细胞治疗技术是通过使用不同来源的干细胞，如成体干细胞、胎儿干细胞和诱导多能干细胞等，来治疗肿瘤。
在这种治疗方法中，科学家们将干细胞注入患者的体内，以修复和恢复受损的组织，并消除肿瘤的侵袭效应。
此外，一些研究表明，使用干细胞可以减少放射治疗和化疗的需求，提高肿瘤治疗的成功率。
二、基因工程基因工程技术是一种通过改变细胞DNA序列来调节细胞功能和特性的技术。
使用基因工程技术治疗肿瘤的一种方法是将治疗基因导入特定细胞，在细胞的DNA中进行改变，以达到治疗目的。
基因工程技术不仅可以发现治疗肿瘤的新方法，还可以协助提高肿瘤治疗的成功率。
三、蛋白质工程蛋白质工程技术是一种使用基因工程技术来开发、设计和制造新的蛋白质的技术。
利用这种技术，科学家们可以合成具有特定功能和特性的蛋白质，并对肿瘤细胞进行攻击。
这种技术在治疗肿瘤中具有潜在的重要作用。
四、生物制品生物制品是通过使用生物反应器和其他生物制品技术制造的替代品，如细胞生长因子、重组干细胞以及蛋白质和细胞疫苗等。
这些生物制品可以用于肿瘤治疗中，以增强免疫系统对肿瘤的攻击力度。
生物制品技术在肿瘤治疗中的使用可能会使治疗更加有效和安全。
五、细胞疗法细胞疗法是一种将受损的组织或器官修复，甚至再生的技术。
在治疗肿瘤中，细胞疗法可以通过治疗受损组织或器官，来对抗肿瘤。
细胞疗法可以是治疗多种类型的肿瘤的潜在新方法之一。
六、再生医学再生医学是一种利用干细胞和机械器械等技术修复和再生人体组织和器官的医学分支。
微球体培养富集肿瘤干细胞及其潜在的临床应用
微球体培养富集肿瘤干细胞及其潜在的临床应用付欣;王珂【摘要】肿瘤干细胞假说是近年来提出的关于肿瘤的新理论，该理论认为肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展和转移等过程中起着决定性的作用，肿瘤干细胞理论的提出给肿瘤治疗提供了新的思路和策略。
但是，肿瘤中只有一小部分细胞为肿瘤干细胞，因此鉴定并富集这些细胞以进一步研究是众多科研人员面临的巨大挑战。
微球体培养技术是近年发展起来的一种有效富集肿瘤干细胞的技术，该技术的应用使肿瘤干细胞的研究变得更加容易，并使临床应用这些细胞来评价肿瘤进展及患者预后成为可能，本文将对该技术及其与微系统的整合进行详细的阐述。
%Cancer stem cell hypothesis has become a new theory. According to this theory, cancer stem cells play a decisive role in car-cinogenesis, progression, and metastasis. This theory offered new ideas and strategies for cancer treatment. However, only a small fraction of cells in a tumor were cancer stem cells. Therefore, the identification and enrichment of these cells are significant challenges for numerous researchers conducting further study. Micro-sphere culture has been an effective tumor stem cell enrichment technolo-gy in recent years. The application of this technique makes the cancer stem cell research process easy. In addition, it makes the evalua-tion of tumor progression and prognosis of patients in clinical possible. This article will focus on the applications of this technology, and microsystem integration will be described in detail.【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2017(044)003【总页数】6页(P136-141)【关键词】肿瘤干细胞;微球体培养;生物标记;微系统【作者】付欣;王珂【作者单位】天津医科大学肿瘤医院妇瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室天津市300060;天津医科大学肿瘤医院妇瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室天津市300060【正文语种】中文肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）假说认为在异质性的肿瘤中只有一小部分细胞具有干细胞的特性，可促进肿瘤生长，并对放化疗有着更强的耐受性［1］。
pbmc肿瘤细胞共培养实验方法
pbmc肿瘤细胞共培养实验方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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肿瘤细胞培养
1、原代培养
这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基 质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代 谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适 用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶 价格昂贵，实验成本高。 步骤：1、按消化分离法收获细胞。 2、待组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化，过筛200目 过掉组织块，大块组织继续消化。 3、收集过滤消化液离心1000rpm/min，5min，去上清加含血清 培养液，轻轻吹打形成细胞悬液，计数后接种到培养瓶，臵 CO2培养箱培养。
细胞生长曲线
肿 瘤 个 人 精 准 医 疗
三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
2、检查项目
软琼脂培养：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些恶性肿瘤 细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软 琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分 化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。 步骤：1、制备1.2%和0.7%浓度的琼脂糖溶液，灭菌备用。 2、制备20%FBS+2x1640+2xPS营养液。 3、铺下胶：1:1混合1.2%与营养液，混匀，凝固，备用。 4、铺上胶：1:1混合0.7%与营养液，加入细胞悬液， 混匀铺到下胶上，凝固后培养箱培养，10-14d。
四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
3、运输 在购买和交换培养细胞时，需根据保存方式和运输时间，采用适当的运输方法。 1、充液法运输：选生长良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养 液，加入新鲜培养液至培养瓶颈部(保留少量空气)，拧紧 瓶盖，然后用封口膜将瓶口密封。到达目的地后，弃去多 余培养液，臵37℃培养，次日传代。 2、冰瓶运输：在较短时间内运输细胞，可将未冷冻的细胞悬液放入装有碎 冰的冰瓶内，以保持细胞活力。 3、液氮罐运输：细胞冻存后，将有细胞的冻存管放人液氮罐内进行运输。 在液氮罐搬运过程中，要防止液氮外漏。
肿瘤细胞原代培养
肿瘤细胞原代培养肿瘤细胞原代培养是一项重要的实验技术，用于研究肿瘤细胞的生物学特性以及开展抗肿瘤药物的筛选和评估。
本文将介绍肿瘤细胞原代培养的基本原理、操作步骤以及应用前景。
一、基本原理肿瘤细胞原代培养是将从患者体内获得的肿瘤组织分离、培养和传代的过程。
首先，通过手术或穿刺等方式采集到肿瘤组织，将组织切割成小块或将细胞分散成悬浮液。
然后，将组织块或细胞悬浮液接种到含有适当培养基和培养液的培养皿中。
在适宜的培养条件下，肿瘤细胞会依次附着、扩增和形成克隆，形成原代培养物。
原代培养物可经过传代，得到连续的肿瘤细胞株。
二、操作步骤1. 组织采集：使用无菌器械采集新鲜的肿瘤组织，尽量避免污染和损伤。
2. 组织处理：将组织切割成小块或细胞分散成悬浮液，使用胰酶等消化酶加速细胞的分散。
3. 培养基配制：根据具体需要，配制适当的培养基，包括营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 细胞接种：将组织块或细胞悬浮液接种到培养皿中，控制接种密度和培养皿的表面涂层，有利于细胞的附着和生长。
5. 培养条件：保持培养皿内的适宜温度、湿度和气体环境，提供充足的营养物质和生长因子，促进细胞的增殖和分化。
6. 细胞观察：定期观察细胞的形态、增殖情况和污染情况，记录生长曲线和细胞倍增时间。
7. 传代培养：当细胞达到一定密度时，用胰酶等消化酶将细胞从培养皿中解离，重新接种到新的培养皿中，继续培养。
三、应用前景肿瘤细胞原代培养是肿瘤研究和药物筛选的重要工具。
通过原代培养，可以获取患者个体的肿瘤细胞，研究其生物学特性、毒性反应、侵袭和转移能力等。
同时，原代培养还可用于筛选和评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用，为临床治疗提供参考。
肿瘤细胞原代培养还可应用于肿瘤干细胞的研究。
肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，是肿瘤发生、发展和耐药性的关键因素。
通过原代培养，可以分离和培养肿瘤干细胞，研究其特性和调控机制，为肿瘤干细胞治疗提供理论和实验基础。
肿瘤细胞原代培养是一项重要的实验技术，具有广泛的研究和应用价值。
肿瘤干细胞的研究套路-干细胞的成球实验操作步骤
肿瘤干细胞的研究套路-干细胞的成球实验操作步骤肿瘤干细胞是是一群既具有自我更新能力又具有较强的侵袭迁移的细胞，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。
肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的金标准。
肿瘤干细胞成球实验一般将分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养，但也可以细胞系做。
恶性程度高的细胞系是很容易成球的，但有的细胞系很困难，所以一般建议用肿瘤干细胞培养，细胞容易成球。
一：一般选择多大的培养皿，6孔板？培养皿可以选择6，12，24孔板，也可以选择100 mm培养皿；二：接种密度？10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索？有没参考密度？密度需要自己摸索。
低密度常用于原代肿瘤干细胞的提取，筛选可以非粘附生长的细胞。
高密度用于细胞球的扩增，一般来说5000个/ml以上的细胞量成球比较好。
三：怎么换液？一周加两次完全培养基。
以6孔板为例，每次加入500ul，加入后轻轻摇匀，细胞球生长很缓慢，培养基中的生长因子至少能够支持2周以上。
直接加入肿瘤干细胞无血清完全培养基，不推荐直接添加的细胞生长因子，确实会影响成球质量。
一旦成球后需要消化传代，细胞球传代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。
据说Accutase和Dispase也可以。
消化步骤如下：170μm的细胞筛过滤收集细胞球，TrypLE Express消化。
22%BSA溶液终止消化，PBS清洗细胞2次。
3重悬细胞，计数。
4用超低吸附的细胞培养板培养细胞（6孔板中每孔加入大约1000个细胞）。
5培养大约10-14天，观察细胞成球情况并计算SPF。
成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。
其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。
SFE的计算方法：SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数/ 每孔中原始接种细胞的总数。
肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。
当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。
另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。
肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%〜5%）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis ）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。
一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。
用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。
也可以考虑动物媒介培养。
根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。
具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。
二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。
三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。
近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。
但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。
众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。
另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。
肿瘤干细胞分离与分析技术
肿瘤干细胞分离与分析技术肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）是肿瘤组织中具有增殖、分化、自我更新和肿瘤形成能力的一类细胞。
与普通癌细胞相比，TSC在肿瘤生长、转移和复发中起着关键作用。
因此，对TSC进行分离和分析具有重要的临床意义，有助于深入了解肿瘤的病理生理和治疗机制。
一、TSC分离技术TSC在肿瘤组织中数量极少，且不同类型的肿瘤中的TSC表达不同，因此TSC的分离技术具有一定的挑战性。
传统的TSC分离技术主要包括限制性稀释法、流式细胞术、排序细胞术和磁珠分选法。
1. 限制性稀释法这种方法是将肿瘤细胞以一定的浓度进行限制性稀释，使得每个细胞单独生长成一个肿瘤球体，由此分离出TSC。
这种方法简单易行，但效率较低，且分离出的细胞存活率较低。
2. 流式细胞术流式细胞术是一种高通量的TSC分离技术，可以通过TSC表面标志物鉴定和分离。
目前已经鉴定出许多TSC表面标志物，如CD44、CD133和CD24等。
通过流式细胞术，可以精确地分离出TSC，但仍存在一定的误差。
3. 排序细胞术排序细胞术是流式细胞术的一种改良方法，也是一种基于细胞表面标志物鉴定的技术。
与流式细胞术不同的是，排序细胞术采用电子脉冲或光束来分离细胞。
这种方法能够减少细胞损伤，提高细胞分离效率。
4. 磁珠分选法磁珠分选法是一种基于TSC表面标志物的分离技术，通过在TSC表面标志物上结合磁珠，然后用磁力分离出TSC。
这种方法具有高效、不依赖特殊设备且可以大规模筛选的优点。
二、 TSC分析技术TSC分析技术包括细胞培养、体外转移和肿瘤形成等实验方法。
这些方法可以用于探究TSC在肿瘤生长、治疗耐药和复发中的作用机制。
1. 细胞培养TSC细胞培养是TSC分离后的第一步，通过这种方法可以得到足量、纯度高的TSC，并且可以探究TSC的稳定性、增殖能力和分化能力。
目前，培养TSC的常用培养基为鼠肝基质上清液（Matrigel）。
在Matrigel中培养的TSC可以保持其自我更新和分化能力，从而为肿瘤的治疗提供理论基础。
肿瘤干细胞的悬浮培养方法[发明专利]
![肿瘤干细胞的悬浮培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/92a4555549d7c1c708a1284ac850ad02de8007a5.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.16C N 103352027 A (21)申请号 201310163367.0(22)申请日 2013.05.07C12N 5/095(2010.01)C12N 5/02(2006.01)(71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433 上海市杨浦区翔殷路800号(72)发明人刘善荣 肖潇 胡晶晶(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268代理人赵青(54)发明名称肿瘤干细胞的悬浮培养方法(57)摘要本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域。
本发明的目的是提供一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，可通用于不同组织来源的肿瘤细胞的培养，而且该培养方法获得的肿瘤干细胞具有自我更新能力、且富集。
本发明提供的一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，是将所需要培养的肿瘤细胞消化离心收集后，用PBS 重悬离心，加入本发明制备的悬浮培养基中，吹打成单细胞悬液，再接种于铺制好的超低吸附培养皿中；进行细胞培养。
本发明的方法体外培养各类肿瘤细胞的成球率高，表达多能性因子，OCT4、NANOG 比例都有所增高，为肿瘤干细胞的研究提供了丰富而全面的实验材料，在基础研究及临床应用上都具有广泛的前景。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图3页(10)申请公布号CN 103352027 A*CN103352027A*1/1页1.一种肿瘤干细胞的悬浮培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、超低吸附培养皿的铺制（a）超低吸附胶的制备：聚甲基丙烯酸2-羟乙脂，用95%的酒精混匀，终浓度为12mg/ ml；（b）用移液器将超低吸附胶覆盖于培养皿底部，吸干残余胶，终密度为0.8mg/cm2，吹风至完全干燥，紫外照射1小时备用；（c）避光干燥通风保存1-2个月；B、悬浮培养基的制备（a）在超净工作台内向基础培养基DMEM/F12中加入胰岛素样生长因子IGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF，吹打混匀；所述的IGF浓度为10-30ng/ml，bFGF 浓度为1.0-3ng/ml，EGF浓度为20-30ng/ml，浓度均相对于基础培养基DMEM/F12而言；（b）4℃避光保存1-2个月；C、细胞培养将所需要培养的肿瘤细胞消化离心收集后，用PBS重悬离心5-10分钟，2-3次，加入步骤B制备的悬浮培养基，吹打成单细胞悬液，接种于步骤A铺制好的超低吸附培养皿中；培养从开始起每三天收集全部培养基，离心换一次新鲜的各类培养基，培养时间是7天，7天后用accutase消化酶，轻轻吹打消化成单细胞进行1:2传代，重复前述操作进行传代培养过程；培养环境：温度为35-38℃、CO2浓度为5-8%、湿度为饱和湿度。
肿瘤干细胞研究与治疗方法
肿瘤干细胞研究与治疗方法引言:癌症作为世界范围内一大死因，对于我们的健康构成了威胁。
近年来，肿瘤干细胞已经成为了科学家们关注的焦点之一。
肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，被认为是肿瘤生成、复发、转移以及耐药性的关键因素。
本文将重点探讨肿瘤干细胞的相关研究现状以及当前的治疗方法。
一、肿瘤干细胞概述1.1 什么是肿瘤干细胞肿瘤干细胞（Tumor-initiating cells, TICs）又称癌干细胞（Cancer stem cells, CSCs），是指在原始肿瘤组织中存在的一小部分干细胞样群体。
与普通癌细胞相比，肿瘤干细胞具有更强的自我更新和增殖能力，并能够通过分化产生各种类型的癌细胞。
1.2 肿瘤干细胞特征肿瘤干细胞具有以下特征：1) 自我更新能力，可以不断自我复制产生新的干细胞；2) 多向分化潜能，可以生成具有多种细胞类型功能的后代细胞；3) 耐药性，能够耐受化疗和放疗等治疗手段；4) 促进癌肿生长与转移。
二、肿瘤干细胞在肿瘤发生和发展中的作用2.1 肿瘤干细胞与肿瘤生成通过诱导分化和对不同信号通路的调控，肿瘤干细胞能够产生各类癌细胞并形成初级肿瘤。
它们具有更高的增殖潜能，因此在肿瘤发生中起到重要作用。
2.2 肿瘤干细胞与肿瘤复发传统治疗方法常常难以完全根除肿瘤组织，并且易造成耐药性。
而在治疗过程中被清除了一部分癌细胞后，剩余的干细胞会重新兴活并引发复发。
由于其高度自我更新和增殖能力，肿瘤干细胞是肿瘤复发的罪魁祸首。
2.3 肿瘤干细胞与肿瘤转移肿瘤转移是癌症治疗失败、死亡的主要原因之一。
肿瘤干细胞通过脱落、浸润以及重新定居等方式完成转移过程。
它们具有类似于造血系统中造血干细胞的移行特性，可以进入血液循环或淋巴系统，并定居到远处器官形成新的转移灶。
三、肿瘤干细胞的治疗方法3.1 靶向肿瘤干细胞表面标记物通过寻找和利用特异性标记物来选择性地杀灭肿瘤干细胞，成为了许多治疗策略的关键点。
例如，使用单克隆抗体、针对特定表面标记物和配体的药物等方式可以达到这一目标。
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肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。
肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。
肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。
无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。
总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。
基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。
附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。
一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。
胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。
LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth Factor ,TGFβ)和叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。
(二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以诱导干和祖细胞增生。
SCF主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。
SCF是一种作用于最早期造血干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。
(三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53个氨基酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细胞培养的最常用的添加因子之一。
EGF可显著促使细胞分裂、增殖，在一定浓度范围内(5~20ng/ml),随EGF浓度提高,效应加强。
(四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种分子量为16-18kD由146个氨基酸组成的阳离子多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。
bFGF具有多种生物学功能，可以促进和调节血管内皮细胞、上皮细胞、和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性的许多种细胞的增殖和分化。
二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定和培养。
不同组织来源的肿瘤特性不同的，培养条件也不完全相同，本章就已有报道的从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离的肿瘤干细胞的体外培养体系加以阐述，在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同的肿瘤干细胞建立稳定的体外培养条件。
(一)白血病干细胞ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用悬浮培养体系培养[2]。
ALL急性淋巴细胞白血病患者来源的骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO二甲基亚砜(Manor Park Pharmaceuticals)冻存液将分离得到的MNC在液氮中备用。
培养时以5×105个/mL密度接种在IMDM无血清培养基中，添加了10μg/mL人胰岛素，200μg/mL转铁蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。
使用时以下两组生长因子任选其一：①20ng/mL重组人Fms样酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF和50ng/mL SCF。
②20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。
每周半量换液一次，培养6周后收集细胞用于细胞遗传学和形态学分析。
(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系[3]，在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长，我们称之为乳腺干细胞球。
原代培养时在超低粘附板(Corning)以20000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。
无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂体浸膏。
乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na消化10分钟(Invitrogen)，收集细胞到离心管中800rpm离心。
离心后得到的细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察是否为单个细胞。
10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连的团块数量应该在30到150之间，如果细胞团大于>100需要重复进行消化和过滤的步骤。
外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD44 + / CD24− /low)的培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理，在胶原酶(Roche)和透明质酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37℃消化2小时后通过30μm滤膜后得到单细胞悬液。
以1000个/mL无血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、5μg/mL 胰岛素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。
细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长，每隔3天使用胰酶－EDTA消化2分钟后传代[4]。
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中分离得到乳腺癌干细胞(CD24− /low /CD44 +)，收集细胞500g离心5分钟,使用Hanks’缓冲盐溶液洗涤后以1000个/mL重悬于无酚磺酞的DMEM – F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5μg/mL牛胰岛素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天换液一次[5]。
(三)脑胶质瘤临床获得的肿瘤标本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除红细胞，在充氧的人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液，总的来说，每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。
肿瘤细胞使用TSM(tumor sphere medium)肿瘤细胞球培养基，添加20 ng/ml重组人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1×神经元存活因子NSF(Clonetics)和60μg/ml N－乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为3 ×106。
原代培养三天后免疫磁珠分选得到CD133+脑胶质瘤干细胞，使用上述细胞培养基培养[6]。
也有学者从临床肿瘤组织获得的单个肿瘤细胞悬液在Neurobasal培养基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。
实验中使用的细胞应该在4代之内，分选得到的Nestin+/CD133+细胞即为脑肿瘤干细胞[7]。
大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选的方法得到脑胶质瘤干细胞[8], 在100-mm培养盘中(Nunc)使用无血清的DMEM培养，添加了10μg/ml牛胰岛素、100μg/ml人转铁蛋白、100μg/ml BSA、60ng/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、40ng/ml亚硒酸钠、63μg/ml N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskolin、50units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。
大鼠胶质瘤细胞系9L，无血清NSC增殖培养基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1×B27 (Gibco)。
每隔两天换液一次。
当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0.1%胰酶和1×EDTA (Gibco) 37°C消化10分钟。
通过25μm细胞滤膜(BD Biosciences) 以1000个/ml 密度接种在添加促有丝分裂剂的NSC培养基中每隔两天换液一次，18天后可以进行细胞的传代，培养的细胞球即为具有化疗抵抗和侵袭能力的肿瘤干细胞样细胞[9]。