2019实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
http://basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
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一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
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注意事项：
1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。 2、配胶后立即灌胶（用滴管） 3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上 （竖直，防漏） 5、加电极缓冲液（注意液面）
4.1 不连续PAGE的原理
三个不连续 三个效应
凝胶孔径不同 缓冲液pH不同 缓冲液离子成分不同 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
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4.2 不连续体系的组份
不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。 1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为
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4.3 样品浓缩效应
1.凝胶孔径不连续性； 2.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； ❖ 在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
3.根据电泳槽体系的类型，分为： （1）圆盘电泳 （2）板状电泳
两者电泳原理完全相同。
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（1）琼脂糖凝胶电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳
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三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
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3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
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五、实验结果的分析
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5.1 相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
清蛋白 1-球蛋白 2-球蛋白 -球蛋白 -球蛋白
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1.3 安装、加样、电泳
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、 不漏水、除气泡）
加buffer（没过上下管口）
样品处理并加样（20ul）
电泳（6mA/管，距底1cm时停止） 剥胶
固定（时间5min）
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳 等有更高的分辨率。
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1.2 浓缩胶的配制
浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，B1D2E1F4，每组 总体积为8ml）
倒掉正丁醇
灌浓缩胶（灌胶高度为1.5cm,上面留1cm空隙加样）
封正丁醇3mm（观察界面，10分钟左右出现折光线 时可倒去正丁醇）
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1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每 组总体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的
电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。
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四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可 进行下一步操作）
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注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加 量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清 洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
染色（时间2min）
漂洗脱色至背景透亮
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二、电泳基本原理及相关知识
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3%胶
Gly - Pro - Cl-
Gly Pro Cl-
Gly Pro Cl-
Gly -
Pro Cl-
Gly -
Pro Cl-
pH为8.3的电泳缓冲 液（Tris-Gly）
pH为6.7的浓缩胶
有效泳动率：
MCl->
M
Pro
>
M
Gly
6%胶
pH为8.9的分离胶
有效泳动率：
MCl->
M
Gly->
M
Pro
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3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类
1. 根据其有无浓缩效应，分为： （1）连续系统——连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，
带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
1、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺聚合而形成 的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。 (1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙 二胺（TEMED）为加速剂, TEMED催化AP产生自由基； (2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由基。 自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链 间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。
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6.9
6.1
2.1~30.8 7.3
4.1~72.5 6.8
1.2~25 7.6
15.6
8.0
分 布(%)
55 5.0 9.0 13.0 11.0
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5.2 结果示意图
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
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四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
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SDS-PAGE的原理
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术 最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分 子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：
2. 溶液pH与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量 3. 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
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2.4 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）
1. 纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物 2. 醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物 3. 凝胶电泳
2.1 电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定 的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定.
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2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
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3.2 聚丙烯酰胺凝胶的特性
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
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2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，此 时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘 氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
❖ 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
3.电位梯度的不连续性。
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pH6.7的Tris-HC1。 2. 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9
Tris-HC1。 3. 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成 了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
1.去电荷：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电， 使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋 白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.破坏结构：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中 可能会形成分别对应于各个亚基的几条带； 3.统一构象：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合 物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长 度都一样，约为18A；
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分 子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子
贾跃腾 罗世翔
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实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
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注意事项：
1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。 2、配胶后立即灌胶（用滴管） 3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上 （竖直，防漏） 5、加电极缓冲液（注意液面）
4.1 不连续PAGE的原理
三个不连续 三个效应
凝胶孔径不同 缓冲液pH不同 缓冲液离子成分不同 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
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4.2 不连续体系的组份
不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。 1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为
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4.3 样品浓缩效应
1.凝胶孔径不连续性； 2.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； ❖ 在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
3.根据电泳槽体系的类型，分为： （1）圆盘电泳 （2）板状电泳
两者电泳原理完全相同。
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（1）琼脂糖凝胶电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳
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三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
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3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
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五、实验结果的分析
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5.1 相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
清蛋白 1-球蛋白 2-球蛋白 -球蛋白 -球蛋白
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1.3 安装、加样、电泳
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、 不漏水、除气泡）
加buffer（没过上下管口）
样品处理并加样（20ul）
电泳（6mA/管，距底1cm时停止） 剥胶
固定（时间5min）
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳 等有更高的分辨率。
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1.2 浓缩胶的配制
浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，B1D2E1F4，每组 总体积为8ml）
倒掉正丁醇
灌浓缩胶（灌胶高度为1.5cm,上面留1cm空隙加样）
封正丁醇3mm（观察界面，10分钟左右出现折光线 时可倒去正丁醇）
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1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每 组总体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的
电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。
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四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可 进行下一步操作）
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注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加 量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清 洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
染色（时间2min）
漂洗脱色至背景透亮
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二、电泳基本原理及相关知识
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Gly - Pro - Cl-
Gly Pro Cl-
Gly Pro Cl-
Gly -
Pro Cl-
Gly -
Pro Cl-
pH为8.3的电泳缓冲 液（Tris-Gly）
pH为6.7的浓缩胶
有效泳动率：
MCl->
M
Pro
>
M
Gly
6%胶
pH为8.9的分离胶
有效泳动率：
MCl->
M
Gly->
M
Pro
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3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类
1. 根据其有无浓缩效应，分为： （1）连续系统——连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，
带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
1、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺聚合而形成 的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。 (1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙 二胺（TEMED）为加速剂, TEMED催化AP产生自由基； (2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由基。 自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链 间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。
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6.9
6.1
2.1~30.8 7.3
4.1~72.5 6.8
1.2~25 7.6
15.6
8.0
分 布(%)
55 5.0 9.0 13.0 11.0
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5.2 结果示意图
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
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四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
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SDS-PAGE的原理
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术 最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分 子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：
2. 溶液pH与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量 3. 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
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2.4 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）
1. 纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物 2. 醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物 3. 凝胶电泳
2.1 电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定 的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定.
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2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
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3.2 聚丙烯酰胺凝胶的特性
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
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2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，此 时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘 氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
❖ 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
3.电位梯度的不连续性。
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pH6.7的Tris-HC1。 2. 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9
Tris-HC1。 3. 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成 了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
1.去电荷：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电， 使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋 白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.破坏结构：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中 可能会形成分别对应于各个亚基的几条带； 3.统一构象：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合 物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长 度都一样，约为18A；
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分 子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子