干扰素的工艺制备流程图
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基因工程药物——干扰素的制备PPT课件
•宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） •上市产品：IFN α-2b/安福隆 •表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 •工艺特点：发酵周期短（几个小时），无需变性、复 性过程，获得有活性产品，纯化过程：淘汰抗体亲和 层析
病毒的克星——干扰素！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：细胞培养，分泌表达 缺点：产量低，成本高,过程严格
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多 微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细 胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的， 通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。 人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在 血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰 素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗 一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是 名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。 既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗 传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产， 也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。 1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作， 他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。 如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比 利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方 法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙 型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一 定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药 物，具有非常诱人的前影。
病毒的克星——干扰素！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：细胞培养，分泌表达 缺点：产量低，成本高,过程严格
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多 微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细 胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的， 通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。 人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在 血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰 素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗 一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是 名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。 既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗 传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产， 也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。 1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作， 他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。 如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比 利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方 法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙 型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一 定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药 物，具有非常诱人的前影。
干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
第三十四页，共45页。
〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
第三十五页，共45页。
4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
第十二页，共45页。
1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物的应用领域
肿瘤治疗
基因工程药物在肿瘤治疗 中发挥了重要作用，如干 扰素、白细胞介素等免疫 调节，基因工 程药物提供了有效的治疗 手段，如囊性纤维化、血 友病等。
抗病毒治疗
针对某些病毒性疾病，基 因工程药物可以起到抗病 毒和免疫调节的作用，如 艾滋病、肝炎等。
干扰素的临床应用与疗效
干扰素在临床上主要用于治疗病 毒性感染、肿瘤以及一些自身免
疫性疾病。
通过注射或雾化吸入给药，干扰 素可有效抑制病毒复制，缓解疾 病症状，提高患者生存率和生活
质量。
然而，干扰素也存在一些副作用 ，如发热、肌肉酸痛、肝肾功能 异常等，需要在医生的指导下合
理使用。
03
基因工程制备干扰素的流程
目的基因的表达
在培养条件下，目的基因在细胞内表达，产生相应的蛋白质或核酸产物。
干扰素的分离纯化
分离方法
采用离心、过滤、萃取等方法，将目 的产物从细胞培养液中分离出来。
纯化方法
通过凝胶电泳、色谱技术（如离子交 换、亲和、排阻等）、超滤等方法， 将目的产物进行纯化。
04
干扰素的质量控制与安全性评 价
。
免疫学评价
检测干扰素对机体免疫系统的影响 ，如免疫原性、抗体产生情况等， 以评估其免疫安全性。
不良反应监测
对临床使用过程中出现的不良反应 进行监测和记录，及时处理并分析 原因，确保患者用药安全。
干扰素的稳定性研究
温度稳定性
研究干扰素在不同温度下的稳定性， 确定其保存、运输和使用的适宜温度 范围。
极具挑战性。
生产成本高
基因工程药物的生产通常需要昂 贵的设备和精细的工艺控制，这 导致了干扰素的生产成本居高不
下。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程 课件
2023-11-12
contents
目录
• 干扰素概述 • 基因工程干扰素制备的基础原理 • 基因工程干扰素的制备流程 • 干扰素的质量控制与临床应用
01
干扰素概述
干扰素的定义与种类
定义
干扰素是一类由细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质。
种类
根据产生来源和结构特点，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干扰素（包括α和β干扰 素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学功能
抗病毒作用
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过激活细胞内的抗病 毒蛋白，降解病毒RNA，从而
阻止病毒感染。
抗肿瘤作用
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节作用
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，提高机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
根据干扰素的种类和活性，选择合适的干扰素基因作为目标 基因。通常选择具有高效抗病毒、抗肿瘤等活性的干扰素基 因。
基因的获取方法
可以通过从自然来源CR等 技术进行基因的扩增和纯化。
基因表达系统的选择与构建
基因表达系统的选择
进行表达。
干扰素的发酵生产
01
02
03
发酵条件优化
调整培养基成分、温度、 pH等发酵条件，使宿主细 胞在最佳状态下生长并表 达干扰握干扰素在发酵过程 中的表达情况和宿主细胞 的生长状态。
发酵产物收获
在发酵结束后，收集发酵 液，并进行初步处理，以 备后续的分离与纯化。
04
干扰素的质量控制与临床应用
干扰素的质量控制标准
2023-11-12
contents
目录
• 干扰素概述 • 基因工程干扰素制备的基础原理 • 基因工程干扰素的制备流程 • 干扰素的质量控制与临床应用
01
干扰素概述
干扰素的定义与种类
定义
干扰素是一类由细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质。
种类
根据产生来源和结构特点，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干扰素（包括α和β干扰 素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学功能
抗病毒作用
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过激活细胞内的抗病 毒蛋白，降解病毒RNA，从而
阻止病毒感染。
抗肿瘤作用
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节作用
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，提高机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
根据干扰素的种类和活性，选择合适的干扰素基因作为目标 基因。通常选择具有高效抗病毒、抗肿瘤等活性的干扰素基 因。
基因的获取方法
可以通过从自然来源CR等 技术进行基因的扩增和纯化。
基因表达系统的选择与构建
基因表达系统的选择
进行表达。
干扰素的发酵生产
01
02
03
发酵条件优化
调整培养基成分、温度、 pH等发酵条件，使宿主细 胞在最佳状态下生长并表 达干扰握干扰素在发酵过程 中的表达情况和宿主细胞 的生长状态。
发酵产物收获
在发酵结束后，收集发酵 液，并进行初步处理，以 备后续的分离与纯化。
04
干扰素的质量控制与临床应用
干扰素的质量控制标准
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程课件•引言•基因工程药物制备基础•干扰素制备流程详解•质量控制与安全性评估目•临床应用与市场前景•总结与展望录干扰素的基因克隆与表达目的基因的获取从人或动物细胞中提取干扰素基因，或通过化学合成方法获得。
基因克隆将目的基因插入到合适的载体中，如质粒、病毒等，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入到宿主细胞中，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等，进行基因表达，产生干扰素蛋白。
通过机械、化学或酶解等方法破碎细胞，释放干扰素蛋白。
细胞破碎初步纯化高度纯化利用离心、过滤、层析等技术对干扰素蛋白进行初步纯化，去除杂质和宿主细胞蛋白。
通过高效液相色谱、凝胶过滤层析等技术对干扰素蛋白进行高度纯化，获得高纯度的干扰素制品。
030201干扰素的分离纯化干扰素的制剂与质量控制制剂工艺将纯化后的干扰素蛋白进行制剂加工，如冻干、分装等，制备成适合临床使用的干扰素制剂。
质量控制对干扰素制剂进行质量检测和控制，包括外观、纯度、活性、安全性等方面的检测，确保产品质量符合规定标准。
基因工程药物是指利用基因工程技术生产的药物，包括基因重组蛋白质、基因治疗剂、基因疫苗等。
具有高效、特异性强、安全性高等优点，已成为现代医药产业的重要组成部分。
基因工程药物概述特点定义干扰素介绍定义干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的蛋白质，是机体天然免疫的重要组成部分。
分类根据结构和功能不同，干扰素可分为α、β、γ等多种类型，其中α-干扰素是临床上应用最广泛的一种。
制备流程研究背景随着重组DNA技术的不断发展，利用基因工程技术生产干扰素已成为可能。
市场需求干扰素具有广泛的临床应用价值，市场需求量大，因此研究其制备流程具有重要意义。
基因重组通过体外DNA重组技术，将目的基因与载体DNA进行切割、拼接，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录和翻译系统，表达出具有特定生物学活性的蛋白质分子。
干扰素制备的工艺流程图课件
干扰素的制备流程
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
PPT学习交流
6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
PPT学习交流
6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
干扰素制备的工艺流程图
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
目的基因与克隆载体进行体 外重组
1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再 把干扰素基因的PCR产物用相应的 酶酶切,用连接酶连接
2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰 素序列比对。
3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导 入受体细胞,筛选
4.菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰
素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌 体于一20 ℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5 小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到 最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆 菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策 略进行过程控制。
干扰素制备的工艺流 程图
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
(3).pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵 条件所决定。干扰素- α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐 受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH,从而造成大量蛋白酶失活减 少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
干扰素生产工艺 - 副本
溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
(2) 沉淀与疏水层析
等电点沉淀（1 ）：磷酸调节至 pH5.0 ，沉淀杂蛋 白，离心收集上清液。
疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白
洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。
等电点沉淀（ 2 ）：磷酸调节 pH4.5 ，调节电导值 40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜
超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。
透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤 膜，0.005 M缓冲液。
(3)阴离子交换层析与浓缩
0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱，
配合SDS-PAGE收集干扰素峰。
浓缩：调整溶液和电导， 10 ku 超滤膜， 0.05M 醋 酸缓冲液（pH5.0）中透析。
（4)阳离子交换层析与浓缩
用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。
盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱
配合SDS-PAGE收集干扰素峰。
浓缩：10 ku超滤膜进行。
(5)凝胶过滤层析
洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0） 清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分
菌体裂解 预处理Fra bibliotek
初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟） 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
重组人干扰素生产工艺(精品PPT)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生
功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用
抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。
第五页，共四十五页。
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能 增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成 IgE。
第十一页，共四十五页。
1.4 重组(zhònɡ zǔ)干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性
角膜炎。 直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤(ròuliú)、
非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕 多发性硬化症 rhuIFNβ
第四页，共四十五页。
天然(tiānrán)干扰素 分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等
功能(gōngnéng) ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱〕
其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ〔IFN )
功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用
抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。
第五页，共四十五页。
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能 增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成 IgE。
第十一页，共四十五页。
1.4 重组(zhònɡ zǔ)干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性
角膜炎。 直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤(ròuliú)、
非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕 多发性硬化症 rhuIFNβ
第四页，共四十五页。
天然(tiānrán)干扰素 分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等
功能(gōngnéng) ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱〕
其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ〔IFN )
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
纯化方法
采用色谱（如凝胶过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱、离子交 换色谱）、电泳等纯化技术，进一步 分离和纯化干扰素蛋白质。
纯度检测
通过SDS-PAGE、高效液相色谱等方 法检测干扰素的纯度，确保产品质量 。
04
干扰素制备过程中的质量控制
工程菌的质量控制
菌种鉴定
确保所使用的工程菌种是正确的，并通过基因测 序等方法进行验证，防止菌种污染或误用。
降低干扰素制备成本的发展需求
原料与耗材的成本控制
在干扰素的制备过程中，原料和耗材的成本占据了很大比例。因此，寻找更经济 、高效的原料来源，以及降低耗材的使用量，是降低成本的重要途径。
生产工艺的优化与改进
通过优化生产工艺，减少生产步骤、提高生产效率，可以降低干扰素的生产成本 。此外，开发连续化、规模化的生产工艺，实现资源的充分利用和能源的高效利 用，也是降低成本的关键。
种类
根据产生来源和受体特异性，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干 扰素（包括α和β干扰素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型 干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学活性
抗病毒活性
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过诱导细胞产生抗病 毒蛋白，降解病毒RNA、阻止 病毒蛋白合成等方式发挥作用
。
抗肿瘤活性
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节活性
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，增强机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
干扰素在医学领域的应用
抗病毒治疗：干扰素已被广泛应用于 病毒感染性疾病的治疗，如乙型肝炎 、丙型肝炎、尖锐湿疣等。
免疫治疗：干扰素可用于免疫调节， 治疗一些自身免疫性疾病和免疫缺陷 病。
干扰素制备的工艺流程
19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成， 结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复 制。
❖ 2、细菌的收获和裂解 １）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离
心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
第十页，课件共有30页
❖ ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠杆菌中， 构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴定目的工程 菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析质粒稳定性。
第十八页，课件共有30页
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备 成品检定
发酵培养 半成品检定 成品包装
pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
第八页，课件共有30页
四、从大肠杆菌k12获取目的基因
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，
目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另 外重组过程可能会发生基因突变情况
溶液Ⅲ: 5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
第十二页，课件共有30页
❖ 所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。 封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现 分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。 于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾
❖ 2、细菌的收获和裂解 １）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离
心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
第十页，课件共有30页
❖ ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠杆菌中， 构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴定目的工程 菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析质粒稳定性。
第十八页，课件共有30页
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备 成品检定
发酵培养 半成品检定 成品包装
pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
第八页，课件共有30页
四、从大肠杆菌k12获取目的基因
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，
目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另 外重组过程可能会发生基因突变情况
溶液Ⅲ: 5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
第十二页，课件共有30页
❖ 所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。 封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现 分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。 于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾
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EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
❖ 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
3. 干扰素的分离纯化工艺过程
3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程
（4）初级分离
❖ 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 ❖ 离心：连续流离心机，16000 r/min ❖ 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
3. 2、干扰素纯化工艺过程
❖ 溶解粗干扰素 ❖ 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 ❖ 无菌过滤分装
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
❖ 1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
❖ 2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→ → 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
→ 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
❖ 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
❖ 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
(3)离心
❖ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ❖ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ❖ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
❖ 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
❖ 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） ❖ 多发性硬化症 rhuIFNβ
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
基因工程药物 --干扰素的制备
1 什么是干扰素
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
1.Байду номын сангаас天然干扰素的分类
3.1 干扰素分离工艺过程
❖ 菌体裂解 ❖ 预处理 ❖ 初级分离
(1)菌体裂解
❖ 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） ❖ 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ❖ 破碎菌体：2厘米以下的碎块 ❖ 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ❖ 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀
四、受体菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
电泳切取目的基因片段 ❖ 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
扰素基因的PCR产物 ❖ 5.人工加尾形成“粘性末端”
二、构建重组质粒
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
❖ 不同来源的干 扰素
1.2 重组干扰素的临床应用
❖ 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节